新型S1P受体调节剂KRP-203通过激活RISK/SAFE通路保护线粒体功能防治心肌缺血再灌注损伤

《Cell Biology and Toxicology》：The novel sphingosine-1-phosphate receptor modulator KRP-203 prevents myocardial ischemia–reperfusion injury by preserving mitochondrial function through activation of the RISK and SAFE signaling pathways

本研究针对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)临床防治策略有限的难题，发现新型鞘氨醇-1-磷酸受体(S1PR)调节剂KRP-203可通过选择性激活心肌细胞S1PR1，启动再灌注损伤挽救激酶(RISK)和存活激活因子增强(SAFE)信号通路，有效维持线粒体膜电位(MMP)并抑制线粒体通透性转换孔(mPTP)开放，在三种MIRI模型（体内、体外、离体）中均显著改善心功能、减少梗死面积和细胞凋亡。该研究为MIRI防治提供了新型候选药物靶点。

　　

在全球范围内，缺血性心脏病始终是导致死亡的首要原因。对于急性心肌梗死患者，及时恢复血流灌注是挽救濒死心肌的关键措施，但再灌注过程本身可能引发更严重的心肌损伤，这一现象被称作心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury, MIRI）。目前临床实践中缺乏高效防治MIRI的策略，虽然缺血预适应（IPC）和缺血后处理（IPoC）在动物模型中显示出明确保护效果，但其临床应用存在局限性和侵入性操作的问题。因此，开发通过药物模拟IPC/IPoC保护效应的药理 conditioning 策略，成为当前研究热点。

鞘氨醇-1-磷酸（Sphingosine-1-phosphate, S1P）是一种具有生物活性的溶血磷脂，通过结合特定的G蛋白偶联受体——S1P受体（S1PRs）家族发挥多种生物学功能。研究表明，S1P/S1PR信号通路参与IPC和IPoC的心脏保护作用。FTY720作为一种广泛研究的S1PR激动剂，在MIRI模型中显示出保护效果，但由于其非选择性激活S1PR3，可能导致心动过缓等心脏副作用，限制了临床应用。与之相比，KRP-203是一种新型、高选择性的S1PR1激动剂，结构类似FTY720但不对S1PR3产生显著激活，因此可能具有更好的安全性特征。虽然KRP-203在免疫相关疾病治疗中显示出潜力，但其对心肌细胞的直接保护作用及机制尚不清楚。

本研究发表于《Cell Biology and Toxicology》，旨在探究KRP-203预处理是否能够通过心肌细胞S1PR1依赖的方式减轻MIRI，并深入阐明其分子机制。研究人员假设KRP-203可能通过选择性激活心肌细胞上的S1PR1，触发再灌注损伤挽救激酶（Reperfusion Injury Salvage Kinase, RISK）和存活激活因子增强（Survivor Activating Factor Enhancement, SAFE）通路，从而维持线粒体功能完整性，实现对MIRI的防护。

为验证这一假设，研究团队采用了多种关键技术方法：通过体内（大鼠左冠状动脉前降支结扎模型）、离体（Langendorff灌流系统）和体外（H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型）三种MIRI模型评估KRP-203效果；利用生物素标记的KRP-203结合pull-down技术和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定KRP-203结合蛋白；采用分子对接和分子动力学（MD）模拟分析KRP-203与S1PR1的相互作用；通过RNA测序进行转录组分析；使用小干扰RNA（siRNA）和腺相关病毒9（AAV9）携带的短发夹RNA（shRNA）在体外和体内敲低S1PR1表达；通过Western blotting检测信号通路蛋白表达；应用JC-1检测线粒体膜电位（MMP），钙黄绿素荧光评估mPTP开放，DCFH-DA测定活性氧（ROS）水平。

KRP-203预处理减轻大鼠MIRI

研究首先在体内模型中评估了KRP-203对MIRI的保护作用。通过心脏超声检查发现，与IR组相比，1或3 mg/kg KRP-203治疗显著改善左心室收缩功能，表现为左心室舒张末期内径（LVIDd）、收缩末期内径（LVIDs）、舒张末期容积（EDV）和收缩末期容积（ESV）降低，射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）提高。

同时，KRP-203处理显著降低血清肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）水平，改善心肌超微结构和组织病理学变化，减少心肌梗死面积和细胞凋亡。值得注意的是，3 mg/kg剂量并未显示出比1 mg/kg剂量更强的保护效果。

KRP-203在体外和离体模型中减轻MIRI

为排除淋巴细胞参与的可能性，研究进一步在体外和离体模型中评估KRP-203的作用。结果显示，在H9c2细胞中，KRP-203的半抑制浓度（IC₅₀）为20.78μM，0.2、1和5μM浓度的KRP-203均能减轻缺氧/复氧（H/R）诱导的细胞死亡率、LDH释放和细胞凋亡，其中1μM浓度保护效果最显著。在离体心脏模型中，2.5和7.5μM KRP-203预处理均能减少IR诱导的梗死面积、心肌组织病理学变化和凋亡，且2.5μM剂量显示出比7.5μM更好的保护效果。

KRP-203与S1PR1的结合分析

为确定KRP-203心脏保护作用的分子靶点，研究采用生物素标记的KRP-203（Bio-KRP-203）进行pull-down实验。结果显示，Bio-KRP-203能特异性富集心肌细胞中的S1PR1，且这种结合可被过量未标记KRP-203竞争性抑制，而对S1PR2无结合，对S1PR3仅有微弱结合。

分子对接和分子动力学模拟进一步揭示了KRP-203与S1PR1的相互作用模式。稳定性分析显示复合物结构在模拟过程中逐渐稳定，关键结合氨基酸为PHE-291和LEU-290，主要通过范德华力（VDW）和疏水相互作用实现稳定结合。

KRP-203缓解线粒体功能障碍

RNA测序结合KEGG和GO分析显示，KRP-203处理影响的差异表达基因（863个上调，791个下调）主要富集于代谢通路和氧化磷酸化等与线粒体功能密切相关的途径。

实验证实KRP-203处理减轻H/R诱导的线粒体功能障碍，表现为ROS水平降低、mPTP开放抑制、线粒体介导的凋亡通路（细胞色素C、caspase-9和caspase-3）抑制以及MMP改善。

KRP-203激活RISK和SAFE信号通路

Western blotting分析显示，KRP-203处理显著增强心肌细胞和组织中AKT、ERK、GSK-3β、JAK2和STAT3的磷酸化水平，表明KRP-203在MIRI条件下激活RISK和SAFE通路。

S1PR1介导KRP-203对RISK/SAFE通路和线粒体功能的影响

为探讨S1PR1在KRP-203保护作用中的角色，研究通过siRNA在心肌细胞中敲低S1PR1表达。结果显示，S1PR1敲低逆转了KRP-203诱导的AKT、ERK、GSK-3β、JAK2和STAT3磷酸化水平增加，同时恢复了KRP-203对ROS产生、mPTP开放和MMP的影响。

心脏S1PR1敲低逆转KRP-203的心脏保护作用

通过AAV9递送的shRNA特异性敲低心脏S1PR1后，KRP-203对心功能的改善、心肌超微结构和组织病理学变化的缓解、血清CK-MB和LDH水平的降低以及心肌梗死面积和凋亡的减少作用完全消失，证实KRP-203的心脏保护效应依赖于心肌S1PR1。

本研究系统阐明了KRP-203通过选择性激活心肌细胞S1PR1，触发RISK和SAFE信号通路，维持线粒体功能完整性，从而防治MIRI的新机制。与FTY720相比，KRP-203具有更高的S1PR1选择性，可能避免S1PR3激活相关的心脏副作用，展现出更好的临床转化潜力。研究结果不仅拓展了对KRP-203药理特性的认识，也为MIRI防治提供了新的候选药物和潜在靶点。未来研究可进一步探索KRP-203在大型动物MIRI模型中的效果，以及其临床应用的安全性和有效性，为缺血性心脏病的治疗策略开发提供新思路。