基于单细胞转录组学的EGFR阳性肺腺癌福莫替尼治疗前后细胞与分子变化研究

《Genes & Genomics》：Single-cell transcriptomic analysis reveals cellular and molecular changes in EGFR-positive lung adenocarcinoma before and after Furmonertinib treatment

本研究针对EGFR阳性肺腺癌患者对第三代EGFR-TKI福莫替尼的应答和耐药机制尚不明确的问题，通过整合公共和内部单细胞RNA测序数据，系统分析了福莫替尼治疗前后肿瘤和癌旁组织的细胞组成、基因表达和细胞通讯变化。研究发现福莫替尼治疗导致肿瘤细胞比例显著减少，T细胞浸润增加，肿瘤微环境免疫抑制状态缓解，肿瘤细胞出现转录组重编程，细胞间通讯网络重塑。该研究为优化EGFR-TKI治疗策略提供了新的见解。

　　

在肺癌的众多亚型中，肺腺癌（LUAD）作为非小细胞肺癌（NSCLC）中最常见的组织学亚型，一直是全球癌症相关死亡的主要原因之一。值得关注的是，相当一部分肺腺癌患者携带表皮生长因子受体（EGFR）基因的激活突变，这使得EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）成为靶向治疗的重要支柱。尽管第三代EGFR-TKIs如福莫替尼（Furmonertinib）显著改善了EGFR突变肺腺癌患者的预后，但耐药性和肿瘤适应性仍然是临床面临的主要挑战。特别是在肿瘤微环境（TME）中，对福莫替尼应答和适应的细胞与分子机制尚未完全阐明。

近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的突破为高分辨率解析肿瘤异质性和微环境动态变化提供了全新视角。已有研究表明，EGFR-TKI治疗能够深刻改变肿瘤微环境中的免疫景观和细胞间通讯网络，同时影响抗肿瘤免疫和耐药性的产生。然而，关于福莫替尼如何重塑EGFR阳性肺腺癌的细胞组成、转录状态和细胞通讯网络，仍缺乏系统性的研究。

为了深入探索这一科学问题，陈剑等研究人员在《Genes & Genomics》上发表了最新研究成果。该研究通过对福莫替尼治疗前后的EGFR阳性肺腺癌患者肿瘤和配对癌旁组织进行单细胞RNA测序，结合公共数据集和内部测序数据，系统分析了治疗引起的细胞组成变化、基因表达谱改变、通路富集以及配体-受体介导的细胞间通讯。

研究团队采用的主要技术方法包括：单细胞RNA测序技术（使用MobiNova-100平台），Seurat软件包进行单细胞数据分析，DoubletFinder去除双细胞，CellChat分析细胞间通讯，AUCell进行基因集活性评分，以及clusterProfiler进行GO和KEGG功能富集分析。样本来源包括公共数据集CRA001963中的5例EGFR阳性肺腺癌肿瘤样本和5例配对癌旁组织样本，以及宁波大学第一附属医院收集的1例患者治疗前后的配对样本。

单细胞转录组图谱揭示细胞异质性

研究首先构建了EGFR阳性肺腺癌在福莫替尼治疗前后的单细胞转录组图谱。通过UMAP可视化分析，研究人员成功鉴定了上皮细胞、肿瘤细胞、纤毛细胞、内皮细胞、成纤维细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）、浆细胞、B细胞、循环细胞、T细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和肥大细胞等主要细胞类型。特别值得注意的是，研究人员对T细胞进行了两轮亚群分析，首次将T细胞分为CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和调节性T细胞（Tregs），进而对CD4⁺和CD8⁺ T细胞进行了功能亚群的细分，包括初始、中央记忆、效应器和衰竭等特殊亚群。

细胞组成发生显著变化

比较癌症组和治疗组的细胞比例发现，福莫替尼治疗导致了肿瘤微环境的显著重塑。治疗后，肿瘤细胞比例出现最大幅度下降，而T细胞比例则显著增加。此外，癌症相关成纤维细胞（CAFs）和单核细胞的比例在治疗后增加，树突状细胞比例下降。在T细胞亚群中，CD4⁺ T细胞比例增加，CD8⁺ T细胞比例下降。具体而言，CD4⁺效应T细胞（T_eff）和CD4⁺ Th1细胞比例下降，而CD4⁺ Th17细胞和CD4⁺初始T细胞（T_na）比例上升。对于CD8⁺ T细胞，衰竭T细胞（T_ex）比例下降，而终末分化效应记忆T细胞（T_emra）和CD8⁺效应T细胞比例上升。

EGFR表达呈现细胞特异性差异

EGFR表达分析显示，治疗组肿瘤细胞中的EGFR表达显著高于癌症组，这一发现与EGFR突变肺腺癌中已知的适应性耐药机制一致。然而，在不同细胞类型中，EGFR表达呈现出异质性动态变化。在大多数免疫和基质细胞类型中，包括NK细胞、T细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞和B细胞，治疗组的EGFR表达低于癌症组。相反，巨噬细胞、循环细胞、肿瘤细胞和浆细胞在治疗组中表现出更高的EGFR表达。T细胞亚群分析进一步表明，CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和Tregs中的EGFR表达在治疗后均下降。

肿瘤细胞发生转录组重编程

差异基因表达分析发现，福莫替尼治疗后肿瘤细胞中有3,016个基因上调，950个基因下调。功能富集分析表明，上调基因主要与小GTP酶介导的信号转导、核转运、先天免疫应答调节、淋巴细胞和T细胞分化、内体运输、细胞信号传导和转录调控相关。KEGG通路分析显示内吞作用、MAPK信号通路、TNF信号通路和各种病毒感染相关通路富集。相比之下，下调基因主要富集于细胞质翻译、氧化磷酸化、细胞呼吸、ATP合成、核糖体结构和线粒体功能。这些发现表明福莫替尼治疗诱导了肿瘤细胞的广泛转录组重编程，肿瘤细胞可能通过激活替代信号级联和免疫相关过程来应对靶向治疗，同时下调线粒体呼吸、氧化磷酸化和蛋白质合成相关基因，反映了细胞代谢和生物合成能力的抑制。

药物耐受特征活性发生变化

AUCell分析显示，与癌症组相比，福莫替尼治疗组中上调的药物耐受基因集的AUC得分显著更高，而下调基因集的AUC得分显著降低。在单细胞水平上，治疗组所有主要细胞类型对上调基因集均表现出一致的AUC值升高，表明治疗后药物耐受转录程序被广泛激活。

细胞间通讯网络重塑

CellChat分析揭示了福莫替尼治疗后细胞间信号网络的广泛重塑。治疗组中，循环细胞和浆细胞的传入相互作用数量增加，而癌症组中成纤维细胞表现出最强的相互作用强度。重要的是，福莫替尼暴露减弱了多个免疫细胞类型（包括T细胞、循环细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和NK细胞）中的MIF信号轴，这可能有助于缓解免疫抑制和增强抗肿瘤 immunity。相比之下，癌症相关成纤维细胞（CAFs）、纤毛细胞、内皮细胞和成纤维细胞中的LAMC1介导的信号增强，表明基质重塑和组织适应性增加。此外，涉及CAFs和纤毛细胞的AREG-EGFR、EREG-EGFR和HBEGF-EGFR相互作用上调，突出了替代EGFR相关旁分泌通路的激活，这些通路在EGFR-TKI治疗期间与耐药性、修复和肿瘤细胞存活有关。

本研究通过单细胞转录组学分析揭示了福莫替尼治疗在EGFR阳性肺腺癌中诱导的显著细胞和分子变化。研究发现福莫替尼治疗导致肿瘤细胞比例显著减少和肿瘤微环境深刻重塑，包括T细胞浸润增加（特别是CD4⁺ T细胞）和衰竭CD8⁺ T细胞减少，表明免疫抑制微环境向有利方向转变。肿瘤细胞表现出EGFR表达增加，以及以信号传导、免疫和分化通路上调，代谢和蛋白质合成基因下调为特征的转录组重编程。细胞间通讯分析显示免疫抑制信号（如MIF轴）减弱和替代配体-受体相互作用（包括LAMC1和EGFR相关通路）增强。

这些发现为理解福莫替尼应答和耐药机制提供了新的见解，表明肿瘤细胞通过转录组重编程和细胞间通讯网络重塑适应EGFR抑制。治疗后肿瘤细胞中EGFR表达增加可能反映了耐药细胞亚群的选择性富集或补偿性反馈信号，而免疫和基质细胞组成的改变表明微环境在治疗应答中发挥关键作用。这些结果可能为优化EGFR-TKI治疗策略提供重要线索，例如通过联合靶向治疗诱导的适应性变化来预防或克服耐药性。