GLMP通过激活自噬和RhoA通路促进非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药性的机制研究

《npj Precision Oncology》：GLMP promotes EGFR-TKI resistance by activating autophagy and RhoA pathway in non-small cell lung cancer

本研究针对非小细胞肺癌（NSCLC）患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）产生耐药性的临床难题，聚焦于溶酶体相关调控机制。研究人员发现，糖基化溶酶体膜蛋白（GLMP）的过表达通过激活上皮-间质转化（EMT）和自噬流，介导了奥希替尼（Osimertinib）的耐药性。机制上，GLMP通过调控RhoA的泛素化稳定性，协同促进EMT和自噬进程。研究进一步证实，联合抑制RhoA通路（使用Fasudil）和自噬（使用氯喹）可显著逆转耐药性。该成果为克服EGFR-TKI耐药提供了新的生物标志物和联合治疗策略，发表于《npj Precision Oncology》。

　　

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占绝大多数。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）如奥希替尼（Osimertinib）已成为携带EGFR突变的NSCLC患者的一线治疗药物，显著改善了患者的预后。然而，耐药性的出现几乎不可避免，最终导致治疗失败和疾病进展。因此，深入探索EGFR-TKI耐药的分子机制，寻找有效的逆转策略，是当前肺癌研究领域的重大挑战。

以往的研究表明，上皮-间质转化（EMT）和自噬等细胞过程在肿瘤耐药中扮演重要角色。同时，溶酶体作为细胞内的降解中心，其功能异常与多种疾病包括癌症的发生发展相关。但溶酶体功能亢进是否以及如何参与EGFR-TKI耐药，其核心调控分子是什么，这些问题尚不清楚。近期，由梁潇、徐佳丽、舒苏慧等研究人员共同完成，发表在《npj Precision Oncology》上的一项研究，首次揭示了糖基化溶酶体膜蛋白（GLMP）在EGFR-TKI耐药中的关键作用及其双重调控机制。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了生物信息学分析、细胞功能实验（包括MTT、克隆形成、EdU掺入、流式细胞术检测凋亡等）、蛋白质相互作用研究（如免疫共沉淀Co-IP、蛋白质稳定性与泛素化检测）、分子生物学技术（如Western blot、qRT-PCR、染色质免疫沉淀ChIP、双荧光素酶报告基因检测）、自噬流检测（mCherry-GFP-LC3腺病毒系统）、溶酶体功能评估（Lyso-Tracker/LysoSensor染色）以及体内动物模型（裸鼠皮下移植瘤和尾静脉转移模型）。临床样本队列来源于TCGA数据库、GEO公共数据集以及江苏省人民医院收集的患者活检组织（包括40例EGFR-TKI治疗前样本和27例耐药后样本）。

EGFR-TKI耐药肺癌细胞呈现溶酶体功能亢进表型

研究人员首先对四个奥希替尼耐药细胞系的基因表达谱进行分析，发现上调基因显著富集于溶酶体、自噬体等相关通路。他们成功构建了PC9和HCC827细胞的奥希替尼耐药株（PC9OR, HCC827OR），证实耐药细胞的IC₅₀显著升高。通过溶酶体探针染色和溶酶体酶（CTSB, CTSD, CTSL）表达检测，发现耐药细胞确实表现出溶酶体功能亢进的特征。

GLMP的临床相关性

通过对公共数据库和临床样本的分析，研究发现GLMP在肺癌组织中高表达，且与更晚的肿瘤分期和更差的预后相关。在其他一代（吉非替尼、厄洛替尼）和二代（达克替尼）EGFR-TKI耐药细胞系中，GLMP表达也显著上调。对患者治疗前后配对样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和qRT-PCR分析进一步证实，耐药后肿瘤细胞中GLMP表达升高，且治疗前GLMP高表达的患者无进展生存期（PFS）更短。免疫组化（IHC）也在三对配对样本中验证了GLMP蛋白在耐药后组织的上调。

GLMP的激活机制：基因拷贝数扩增与TFEB转录激活

Western blot证实GLMP在奥希替尼耐药细胞中高表达，且奥希替尼处理可进一步诱导其表达。机制探索发现，GLMP在肺癌患者（TCGA）和癌细胞系（CCLE）中存在高频的拷贝数扩增（CNA），且其表达与拷贝数正相关。耐药细胞中GLMP的拷贝数也高于敏感细胞。此外，研究发现溶酶体相关基因的主调控因子转录因子EB（TFEB）能直接结合GLMP启动子并促进其转录。敲低TFEB可降低GLMP表达并部分逆转奥希替尼耐药。

GLMP在体外和体内促进EGFR-TKI耐药

功能实验表明，敲低GLMP可降低耐药细胞对奥希替尼的IC₅₀，抑制细胞增殖并诱导凋亡。在裸鼠皮下移植瘤模型中，敲低GLMP联合奥希替尼治疗能更有效地抑制肿瘤生长和增殖标志物Ki67的表达。

GLMP通过调控RhoA通路诱导耐药

RNA测序和基因集富集分析（GSEA）提示GLMP与RhoA通路密切相关。机制上，GLMP并不影响RhoA的mRNA水平，而是通过蛋白质相互作用抑制RhoA的泛素化降解，从而稳定RhoA蛋白。功能回复实验证实，GLMP促进耐药和细胞增殖的作用依赖于RhoA。

GLMP通过RhoA介导的上皮-间质转化（EMT）调控耐药

敲低GLMP导致上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）上调、间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）下调，而过表达GLMP则相反。动物尾静脉转移模型显示敲低GLMP可减少肺转移结节。联合使用RhoA抑制剂Fasudil和奥希替尼在体外和体内均显示出协同抗肿瘤效应，且此增敏效应在一定程度上依赖于GLMP的存在。

同时抑制自噬和EMT可逆转GLMP介导的EGFR-TKI耐药

研究发现了GLMP和RhoA在自噬调控中的不同角色：敲低RhoA或使用Fasudil主要增加自噬的起始（LC3-II/I比值增加，P62减少），而敲低GLMP则因影响溶酶体功能，阻碍自噬流后期，导致自噬体累积（LC3-II/I和P62均增加）。耐药细胞本身具有溶酶体功能亢进，能维持持续的自噬流。单独使用自噬抑制剂氯喹（Chloroquine）可部分逆转耐药，而联合使用Fasudil和氯喹则能更有效地增强奥希替尼的疗效，且在GLMP敲低的细胞中，这种联合治疗的增效作用减弱，表明其益处部分依赖于GLMP所维持的特定细胞状态。

结论与意义

本研究首次揭示溶酶体膜蛋白GLMP是EGFR-TKI耐药的关键驱动因子。其机制涉及双重调控：一方面，GLMP通过稳定RhoA蛋白，激活RhoA介导的EMT过程，促进肿瘤细胞的侵袭和耐药；另一方面，GLMP维持的溶酶体功能亢进状态保障了自噬流的畅通，而抑制RhoA则会诱导保护性自噬。这两种机制共同构成了耐药细胞生存优势的基础。因此，同时靶向RhoA通路（抑制EMT）和自噬过程，能够有效克服由GLMP上调所介导的EGFR-TKI耐药。该研究不仅深化了对肺癌耐药机制的理解，将溶酶体的作用与经典信号通路（RhoA-EMT）和细胞自噬联系起来，更重要的是为临床逆转EGFR-TKI耐药提供了新的生物标志物（GLMP）和一种有前景的联合治疗策略（RhoA抑制剂+自噬抑制剂），具有重要的转化医学价值。