培养组学与宏基因组学的协同作用：从非IBD和IBD人群分离健康状态相关肠道细菌

《Scientific Reports》：Synergy between culturomics and metagenomics of health status-associated gut bacteria originating from non-IBD and IBD populations

本研究针对炎症性肠病(IBD)研究中缺乏特定菌株实验验证的瓶颈，通过培养组学(culturomics)与宏基因组学(metagenomics)的协同分析，从32份粪便样本中成功分离4,347株细菌（含1,362株IBD来源）。研究证实直接接种法可显著提高Bacillota和Pseudomonadota的物种多样性，并成功分离出与宏基因组组装基因组(MAGs)高度匹配的Bifidobacterium adolescentis菌株，为IBD相关菌株的功能验证提供了宝贵资源。

　　

在人体这个复杂的生态系统里，肠道微生物扮演着不可或缺的角色。它们不仅帮助宿主消化食物、合成维生素，还通过调节免疫系统维护肠道健康。然而当这个微生态平衡被打破——即出现菌群失调(dysbiosis)时，就可能引发一系列疾病，其中炎症性肠病(IBD)便是典型代表。IBD作为一种慢性肠道炎症性疾病，全球有数百万人受其困扰，而肠道菌群的改变被认为是其关键特征之一。

以往的研究通过宏基因组学(metagenomics)技术，已经能够识别出与健康或IBD状态相关的特定细菌种类甚至菌株。例如研究发现IBD患者肠道中Bacillota菌门的相对丰度降低，而Pseudomonadota菌门的相对丰度升高。更精细的研究还发现，同一细菌物种的不同菌株可能在IBD发生发展中扮演不同角色，有些菌株甚至可能通过适应炎症环境而获得生长优势。然而这些基于DNA测序的发现大多停留在相关性层面，要真正理解其因果关系和机制，就需要获得活的细菌菌株进行功能实验验证。这正是当前研究领域的一个重要瓶颈——尽管我们知道"谁"在那里，但我们缺乏"活体代表"来回答"它们做了什么"和"如何做的"。

为了解决这一问题，由荷兰格罗宁根大学医学中心的N. Plomp和H.J.M. Harmsen领导的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们开展了一项规模宏大的培养组学(culturomics)研究，旨在从非IBD和IBD人群的粪便样本中培养并分离与健康状态相关的肠道细菌，特别是那些之前通过宏基因组学鉴定出的IBD相关菌株。

研究人员选择了来自两个大型队列研究的32份粪便样本，包括15份非IBD样本和17份IBD样本（其中13份来自Lifelines荷兰微生物组计划，4份来自RISE-UP研究）。他们设计了一套全面的培养策略，使用了16种厌氧培养基和4种需氧培养基，并比较了两种接种方法：直接接种法（将粪便样本直接涂布在培养基上）和系列稀释法（先将样本稀释再涂布）。所有分离的细菌都通过MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱）进行鉴定，部分菌株还进行了16S rRNA基因测序和全基因组测序。同时，研究人员还利用已有的宏基因组数据，比较了培养组学与宏基因组学在细菌多样性检测方面的差异。

关键技术方法包括：从Lifelines DMP和RISE-UP队列获取32份粪便样本；使用16种厌氧和4种需氧培养基进行细菌培养；比较直接接种与系列稀释两种方法；通过MALDI-TOF MS和16S rRNA测序进行菌株鉴定；对选定菌株进行全基因组测序；与宏基因组组装基因组(MAGs)进行基因组比较分析。

The culturomics of fecal samples with diverse conditions

通过多样化的培养条件，研究人员成功获得了4,347株纯菌株，其中1,362株来自IBD患者，2,985株来自非IBD志愿者。这些菌株涵盖了8个菌门，其中Actinomycetota、Bacillota和Bacteroidota是三大优势菌门。厌氧培养获得了3,552株分离株，代表8个菌门；需氧培养获得了795株分离株，主要属于Bacillota、Pseudomonadota和Actinomycetota。研究还发现了169株无法通过现有MALDI-TOF MS数据库鉴定的菌株，这表明可能含有目前尚未被充分认识的细菌物种。

Direct inoculation of fecal samples yields a higher species richness of anaerobic Bacillota and Pseudomonadota as compared to serial dilutions

研究人员比较了两种接种方法对细菌物种丰富度的影响。结果显示，直接接种法在厌氧条件下对Bacillota和Pseudomonadota的物种分离效果显著优于系列稀释法，平均可获得两倍以上的Bacillota不同物种和1.5倍的Pseudomonadota不同物种。相反，系列稀释法对Actinomycetota的物种分离效果更好，而两种方法对Bacteroidota的分离效果无显著差异。这一发现为优化细菌培养策略提供了重要依据。

Culturomics and metagenomic assembled genomes largely capture the same genera

通过比较培养组学与宏基因组学在属水平上的检测能力，研究人员发现两种方法共检测到93个属，其中61个属（65.6%）被两种方法共同捕获。培养组学独有地发现了24个属（24.7%），而宏基因组学独有地发现了9个属。按菌门分析，培养组学成功捕获了Actinomycetota、Campylobacterota、Fusobacteriota和Verrucomicrobiota的全部属，以及Bacillota（91.8%）和Pseudomonadota（90.0%）的大部分属，显示了两种方法的互补性。

The culturomics approach yielded bacterial species that were associated with the host health status

研究重点关注了之前通过宏基因组学鉴定出的与宿主健康状态最相关的40种细菌。在这40种细菌中，31种在MALDI-TOF MS数据库中有参考谱图，其中22种被成功培养分离。值得注意的是，有18种细菌同时被培养组学和宏基因组学检测到，而Bifidobacterium dentium和Hungatella hathewayi虽然未被宏基因组检测到，但仍被成功分离培养，展示了培养组学在检测低丰度物种方面的优势。

Specific Metagenome-assembled genomes can be isolated with fecal culturomics

为了验证能否分离出与特定宏基因组组装基因组(MAGs)高度匹配的菌株，研究人员对从同一参与者粪便中分离的3株Bifidobacterium adolescentis进行了全基因组分析。数字DNA-DNA杂交(dDDH)和平均核苷酸一致性(ANI)分析显示，两株分离株(8825-Y2b和8825-B1)与来自同一参与者的MAG高度相似（dDDH≥99.5%，ANI≥99.90%）。单核苷酸多态性(SNP)分析进一步证实了这些菌株与对应MAG的紧密关系，差异SNP数量在可视为同一菌株的范围内。基因注释分析显示，尽管存在少量基因差异，但核心基因组高度保守。

这项研究建立的培养集合不仅包含了与健康或IBD强相关的细菌菌株，更重要的是展示了培养组学与宏基因组学的协同效应。研究人员成功分离出了与特定MAGs高度匹配的菌株，这为后续的功能验证实验提供了关键资源。例如，对Bifidobacterium adolescentis菌株的深入分析表明，培养分离的菌株与宏基因组数据中重建的基因组高度一致，这为研究菌株水平的功能差异奠定了基础。

研究的讨论部分指出，尽管培养组学工作量巨大，但通过基于测序结果有针对性地选择样本进行培养，可以更有效地分离低丰度物种和多种菌株。此外，分离菌株的基因组序列可以作为宏基因组组装的支架，提高MAGs的质量，从而形成良性循环。

这项研究的真正价值在于它为IBD研究领域提供了宝贵的实验材料。随着对IBD发病机制理解的深入，研究人员越来越意识到不同菌株可能在疾病中扮演不同角色。而本研究提供的培养集合，使得科学家能够直接测试特定菌株的生物学功能，探索它们与宿主免疫系统的相互作用，以及它们在肠道微环境中的生态位适应机制。

这项研究不仅扩展了人类肠道可培养细菌的资源库，更重要的是建立了一个将宏基因组学发现与实验验证连接起来的平台。随着更多针对性的功能实验的开展，我们有望真正理解肠道菌群在IBD发生发展中的具体作用机制，为开发新的治疗策略奠定基础。这项工作的意义不仅在于它提供了"谁"在那里，更重要的是它为我们提供了工具来回答这些细菌"做了什么"以及"如何做的"这一根本问题。