蝎毒重组磷脂酶A2（Maurolipin）展现抗利什曼原虫潜力及其机制研究

《Scientific Reports》：The recombinant protein of scorpion venom phospholipase A2 exhibits potential anti-leishmanial activity

本研究针对利什曼病现有疗法毒副作用大、耐药性突出的临床困境，首次成功在大肠杆菌Origami(DE3)系统中表达并纯化伊朗蝎Scorpio maurus来源的重组磷脂酶A2（Maurolipin）。实验证实该蛋白对硕大利什曼原虫（Leishmania major）前鞭毛体具有显著生长抑制（IC50为6.5μg/ml）和直接杀伤作用（LC50为9.06μg/ml），其活性呈浓度和时间依赖性。虽然对RAW 264.7巨噬细胞存在细胞毒性（24小时IC50为6.62μg/ml），但该研究为基于蝎毒蛋白开发新型抗寄生虫药物提供了重要候选分子和实验依据。

　　

在热带与亚热带地区的公共卫生领域，利什曼病（Leishmaniasis）一直是一个沉重的负担。这种由利什曼原虫（Leishmania）引起的寄生虫病，主要通过白蛉叮咬传播，可导致从皮肤溃疡到致命的内脏感染等多种临床表现。其中，由硕大利什曼原虫（Leishmania major）引起的人畜共患型皮肤利什曼病（Zoonotic Cutaneous Leishmaniasis, ZCL）在旧世界（Old World）许多地区广泛流行，给患者带来长期的痛苦和社交障碍。数十年来，五价锑化合物（如葡萄糖酸锑钠）一直是治疗利什曼病的一线药物，但它们的临床应用却面临着严峻挑战：严重的肝毒性、心毒性、肾毒性等副作用常常让患者难以耐受，治疗过程本身也充满痛苦。更糟糕的是，利什曼原虫耐药株的出现以及药物在不同地区的疗效差异，使得现有治疗方案的效果大打折扣。因此，全球科学家们都在迫切地寻找更安全、更有效的新型抗利什曼药物。

自然界一直是新药发现的重要宝库，蝎子作为一种古老的节肢动物，其毒液中含有大量具有独特生物活性的多肽和酶类。虽然蝎蛰伤对人类健康构成威胁，但对其毒液成分的深入研究却揭示了其在药物开发领域的巨大潜力。蝎毒成分已被报道具有抗菌、抗病毒、镇痛乃至抗癌等多种药理活性。其中，磷脂酶A2（Phospholipase A2, PLA2）是一类能够水解细胞膜磷脂sn-2位酯键的关键酶，其水解产物——溶血磷脂和脂肪酸，不仅是重要的信号分子，也能直接破坏细胞膜结构。此前的研究多集中于蛇毒PLA2在抗癌、抗寄生虫方面的作用，而对蝎毒来源的PLA2，特别是其抗利什曼活性的探索则相对匮乏。

基于此，由Parisa Soltan-Alinejad、Kourosh Azizi等研究人员组成的研究团队，将目光投向了伊朗蝎Scorpio maurus毒腺中一种名为Maurolipin的分泌型磷脂酶A2（sPLA2）。在他们先前的工作中，已经对Maurolipin进行了分子表征和计算机模拟分析。在本项发表于《Scientific Reports》的研究中，他们迈出了关键一步：成功生产出重组的Maurolipin蛋白，并首次系统评估了其对硕大利什曼原虫前鞭毛体的抗寄生虫活性及其对哺乳动物细胞的细胞毒性，为开发基于蝎毒蛋白的新型抗利什曼疗法提供了重要的实验证据。

为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。首先，他们采用基因工程手段，将来自蝎子毒腺的Maurolipin基因克隆到pET-28a表达载体中，并转化至特别适合表达含有复杂二硫键蛋白的大肠杆菌Origami(DE3)菌株进行重组蛋白表达。由于表达的蛋白以不溶性包涵体形式存在，他们采用了杂交纯化策略，即先在变性条件下使蛋白结合至镍柱，再在非变性条件下洗脱，以获得具有生物活性的重组蛋白。其次，他们利用体外寄生虫培养模型，通过细胞计数法评估了重组Maurolipin对硕大利什曼原虫（菌株MHOM/IR/13/Shiraz）前鞭毛体生长的抑制作用，并计算半最大抑制浓度（IC₅₀）。第三，为了检测蛋白的直接杀伤作用，他们使用碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色结合流式细胞术，分析了不同浓度蛋白处理3小时后前鞭毛体的死亡率，并计算半致死浓度（LC₅₀）。最后，为了评估蛋白对哺乳动物细胞的潜在毒性，他们采用MTT比色法检测了重组Maurolipin对小鼠RAW 264.7巨噬细胞活力的影响，并分析了其时间与浓度依赖性。

3. 结果

3-1. 质粒构建与克隆

研究人员成功构建了含有Maurolipin编码基因（782 bp）的重组质粒Maurolipin-pET-28a，并转化至表达宿主大肠杆菌Origami(DE3)中。通过菌落PCR使用通用T7引物进行验证，获得了预期大小的扩增条带（782 bp），证实了重组质粒的正确构建。

3-2. Maurolipin重组蛋白的过表达

通过系统优化诱导条件，包括IPTG浓度（0.25, 0.5, 1 mM）、诱导温度（18°C, 30°C, 37°C）和诱导时间（6或18小时），发现当使用0.25 mM IPTG在30°C下诱导18小时时，Maurolipin蛋白的表达量最高。SDS-PAGE分析显示在诱导的菌株裂解物中有一条约16 kDa的条带，与预期蛋白大小相符。

3-3. Western blot

Western blot分析使用HRP标记的抗His标签单克隆抗体，特异性检测到一条约16 kDa的条带，进一步证实了重组Maurolipin的成功表达。

3-4. Maurolipin的纯化与重折叠

由于蛋白以包涵体形式表达，研究人员采用基于镍柱的杂交纯化方案。首先在变性条件下（含尿素）溶解包涵体并使蛋白结合至树脂，随后通过逐步降低变性剂浓度并最终在天然条件下洗脱，获得了纯化的重组Maurolipin蛋白。SDS-PAGE显示纯化产物在16 kDa处有单一主带，表明获得了高纯度的目标蛋白。

3-5. Maurolipin表达水平

通过酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，并利用白细胞介素-4（IL-4）作为标准蛋白绘制标准曲线，定量得出纯化后的重组Maurolipin蛋白浓度为80 μg/mL。

3-6. 寄生虫生长抑制

将不同浓度的重组Maurolipin蛋白（40 至 0.07 μg/mL）与硕大利什曼原虫前鞭毛体共同孵育24小时后，发现该蛋白对寄生虫生长具有浓度依赖性的抑制作用。在最高浓度40 μg/mL时，抑制率高达90.34%，而在低浓度0.15和0.07 μg/mL时则未观察到抑制。计算得出其24小时生长抑制的IC₅₀值为6.5 μg/mL。

3-7. 抗利什曼活性

通过流式细胞术结合PI染色评估蛋白的直接杀伤作用。结果显示，重组Maurolipin在3小时内即可引起前鞭毛体死亡，且死亡率随蛋白浓度升高而增加。在40 μg/mL浓度下，死亡率达到82.31%。计算得出其3小时杀伤作用的LC₅₀值为9.06 μg/mL。对照实验排除了细菌裂解物中杂质蛋白的非特异性毒性干扰。

3-8. 细胞毒性效应

MTT实验结果表明，重组Maurolipin对RAW 264.7巨噬细胞也具有浓度和时间依赖性的细胞毒性。孵育24、48和72小时后，其IC₅₀值分别为6.62 μg/mL, 4.29 μg/mL 和 1.70 μg/mL，表明随着作用时间延长，细胞对蛋白的敏感性增加。

4. 讨论与结论

本研究首次成功在大肠杆菌Origami(DE3)系统中表达并纯化了蝎子Scorpio maurus毒源的重组磷脂酶A2蛋白Maurolipin，并系统评价了其抗利什曼活性。研究结果明确显示，Maurolipin对硕大利什曼原虫前鞭毛体兼具生长抑制和直接杀伤双重作用，且活性呈显著的浓度依赖性。其作用机制可能不同于传统的酶催化活性，而是通过疏水相互作用直接与寄生虫细胞膜结合，引起膜结构静电扰动和通透性改变，最终导致细胞死亡。这种直接作用于膜结构的机制可能与某些抗菌肽的作用方式类似，为其高效、快速的抗寄生虫效果提供了合理解释。

然而，研究也发现Maurolipin对哺乳动物巨噬细胞存在明显的细胞毒性，其IC₅₀值与抗寄生虫活性的IC₅₀值相近，这提示在开发其作为抗寄生虫药物时，需要仔细权衡其治疗窗（治疗效应与毒副作用的剂量区间），并考虑通过剂型改良（如脂质体包裹）或结构修饰来提高其选择性毒性，即增强对寄生虫的杀伤而对宿主细胞的损害降至最低。

尽管存在细胞毒性的挑战，该研究的发现仍然具有重要意义。它首次证实了蝎毒PLA2在抗利什曼方面的潜力，为从蝎毒这一天然宝库中发掘新的抗寄生虫先导化合物提供了有力证据。与一些蛇毒PLA2的研究结果相比，Maurolipin在相对较短的作用时间内（24小时抑制，3小时杀伤）表现出较强的活性，显示出其独特的优势。此外，其对哺乳动物细胞的毒性也暗示了其在抗癌药物开发领域的潜在价值，这与某些PLA2毒素的研究方向相符。

总之，这项由Parisa Soltan-Alinejad、Kourosh Azizi等完成的研究，不仅成功建立了一种复杂蝎毒蛋白的重组表达和活性回收方法，更重要的是揭示了一个名为Maurolipin的蝎毒PLA2蛋白作为新型抗利什曼药物先导化合物的巨大潜力。尽管前路漫漫，仍需解决其选择性毒性等问题，但这项研究无疑为对抗日益严峻的利什曼病挑战，开辟了一条充满希望的新途径。未来的研究将需要深入探索其作用的具体分子机制，并在动物感染模型中验证其体内疗效与安全性，同时考察其对利什曼原虫无鞭毛体（寄生在巨噬细胞内的阶段）的作用效果，从而更全面地评估其 therapeutic potential（治疗潜力）。