FleQ依赖调控铜绿假单胞菌生物膜生长与感染过程中核糖核苷酸还原酶阻遏蛋白NrdR的机制研究

《Scientific Reports》：FleQ-Dependent regulation of the ribonucleotide reductase repressor NrdR in Pseudomonas aeruginosa during biofilm growth and infection

本研究针对铜绿假单胞菌中三种核糖核苷酸还原酶(RNRs)的主调控因子NrdR的转录调控机制不明确的问题，通过生物信息学筛选和实验验证，首次发现FleQ在浮游生长和急性感染条件下正向调控nrdR表达，而在生物膜形成阶段则转变为抑制角色。该研究揭示了FleQ通过感应第二信使c-di-GMP水平动态调控核苷酸代谢的新机制，为理解病原菌环境适应性提供了重要理论依据。

　　

在微生物感染与治疗的战场上，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)堪称一个狡猾的"多面手"。这种革兰氏阴性机会致病菌不仅能引起急性感染，更擅长建立难以根治的慢性感染，特别是在囊性纤维化(CF)等支气管扩张症患者体内顽固存留。其强大的环境适应能力背后，隐藏着精密的基因调控网络。然而，最令研究人员困扰的是，即使面对抗生素的猛烈攻击，这种病原菌仍能通过快速获得耐药性而存活。这迫使我们寻找新的抗菌策略——靶向细菌生存所必需的"阿喀琉斯之踵"。

DNA的合成与修复是所有生物体的生命线，而核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide Reductase, RNR)是催化核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸(dNTPs)的唯一酶类，为DNA复制提供基本原料。铜绿假单胞菌的独特之处在于其基因组中同时编码三种RNR类别(Ia、II和III类)，使其能够灵活应对有氧、无氧等不同环境条件，尤其是在生物膜形成和感染过程中。然而，这种复杂性也带来了一个科学难题：细菌如何精确协调这三种RNR的表达？

NrdR作为RNR的全局阻遏蛋白，能通过结合保守的NrdR-box motif同时调控三类RNR基因的表达。但一个关键问题尚未解决：谁在调控这位"调控者"？此前研究表明，在厌氧条件下，转录因子NarL能够激活nrdR的表达，但这只是冰山一角。为了全面揭示nrdR的转录调控网络，来自西班牙巴塞罗那科学技术研究所的多明戈·马昌(Domingo Marchan)及其团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，系统阐述了FleQ在不同生长条件下对nrdR的双向调控作用。

关键技术方法包括：通过5'-RACE技术确定nrdR的转录起始位点(TSS)；利用启动子下拉(pull-down)结合液相色谱-质谱(LC-MS)技术鉴定与nrdR启动子结合的蛋白质；采用RT-qPCR和GFP/lux报告基因系统检测基因表达；通过静态和连续流动生物膜模型研究基因表达动态；利用大蜡螟(Galleria mellonella)感染模型进行体内验证。

nrdR基因背景概述与转录因子的生物信息学鉴定

研究人员首先通过实验确定了nrdR的转录起始位点位于起始密码子上游28 bp处。生物信息学分析预测了nrdR启动子区域可能存在多个转录因子结合位点，包括FleQ、LasR、RhlR和NarL的结合 motif。通过实验排除了群体感应(QS)调控因子LasR和RhlR的参与，将研究焦点集中在FleQ上。

下拉实验证实FleQ和NarL与nrdR启动子的结合

由于FleQ蛋白在原核表达系统中易形成包涵体，研究人员创新性地采用启动子下拉实验结合蛋白质组学分析，直接鉴定了与nrdR启动子区域结合的蛋白质。LC-MS分析结果明确显示FleQ和NarL能够与nrdR启动子结合，而LasR和RhlR未被检测到，证实了FleQ对nrdR的直接调控作用。

FleQ在有氧和厌氧条件下激活nrdR转录

通过比较野生型PAO1和ΔfleQ突变株的生长曲线发现，在厌氧条件下，ΔfleQ菌株进入稳定期的时间延迟约3小时。RT-qPCR分析显示，在ΔfleQ突变株中，nrdR的表达量显著降低，表明FleQ是nrdR的正向调控因子。启动子-报告基因实验进一步证实，删除fleQ基因或突变FleQ结合位点均会降低nrdR启动子活性，而回补fleQ基因可逆转这种效应。这些结果一致表明FleQ在浮游生长条件下直接激活nrdR转录。

生物膜形成条件下的NrdR调控

在静态和连续流动生物膜模型中，研究人员观察到一个有趣的现象：与浮游生长条件相反，在生物膜形成过程中，FleQ结合位点突变的菌株表现出更高的nrdR表达水平，特别是在成熟生物膜阶段。这表明FleQ在生物膜条件下转变为nrdR的抑制因子。这种双向调控特性与FleQ在其他靶基因(如pelA)中的调控模式相似，可能受到细胞内c-di-GMP水平的调节。

感染条件下的NrdR表达

利用大蜡螟感染模型，研究人员在体内条件下验证了FleQ对nrdR的调控作用。实验结果显示，野生型PnrdR构建体在感染后15-18小时表达诱导了75.2倍，而FleQ结合位点突变的构建体仅诱导了44.2倍，表明FleQ在感染过程中正向调控nrdR表达。这一结果与浮游生长条件下的发现一致，说明在急性感染环境下，FleQ对nrdR的激活作用占主导。

本研究系统阐明了铜绿假单胞菌中nrdR的复杂调控网络，特别是发现了FleQ作为关键调控因子在不同环境条件下的双向调节作用。在浮游生长和急性感染条件下，FleQ作为激活因子促进nrdR表达，确保细菌在活跃生长阶段有足够的NrdR来精细调控RNR活性和核苷酸代谢。而在生物膜形成过程中，随着细胞内c-di-GMP水平升高，FleQ转变为抑制因子，降低nrdR表达，这可能有助于细菌降低代谢活性，适应生物膜特有的持久性状态。

这一调控机制的揭示不仅深化了我们对细菌环境适应性的理解，更重要的是提供了潜在的新型抗菌靶点。通过干预FleQ-nrdR调控轴，可能能够破坏细菌在浮游状态与生物膜状态之间的转换能力，从而增强现有抗生素的疗效。特别是考虑到铜绿假单胞菌在临床感染中常以生物膜形式存在，导致治疗失败，针对这一通路的抑制剂开发可能为应对多重耐药菌感染提供新策略。

研究的创新性在于首次将运动性与生物膜形成的主要调控因子FleQ与核苷酸代谢的核心调控网络联系起来，揭示了细菌在不同生活方式转换过程中代谢重编程的分子基础。这种跨通路的调控整合可能是细菌高效适应环境变化的重要策略，也为理解其他病原菌的适应性进化提供了新视角。未来研究可进一步探索FleQ感受环境信号的具体机制，以及其与其它已知调控因子(如NarL、AlgR等)之间的协同作用，为开发多靶点抗菌疗法奠定基础。