高通量体外筛选与计算机模拟分析鉴定寨卡病毒抑制剂及其机制研究

《Scientific Reports》：High-throughput in vitro screening and in silico analysis for Zika virus inhibitor identification

本研究针对目前缺乏有效抗寨卡病毒(ZIKV)药物的现状，通过高通量体外筛选348种化合物并结合计算机模拟分析，成功鉴定出包括头孢他辛、多库酯钠和柴胡皂苷B2在内的多个具有强效抗病毒活性的先导化合物。研究综合运用分子对接、分子动力学模拟及ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）特性预测，揭示了这些化合物与ZIKV关键蛋白NS5和NS2B-NS3的相互作用机制，为开发新型抗ZIKV疗法提供了重要的实验依据和候选分子。

　　

寨卡病毒(Zika Virus, ZIKV)是一种由蚊子传播的黄病毒，自1947年在乌干达的寨卡森林首次被发现以来，已引发多次疫情，特别是2015年巴西的暴发导致世界卫生组织宣布其为国际关注的突发公共卫生事件。该病毒与严重的神经系统并发症相关，包括新生儿小头畸形和成人吉兰-巴雷综合征。尽管近年来病例数有所下降，但ZIKV仍被专家称为“沉默病毒”，具有再次暴发的潜在风险。目前，全球范围内尚无获批的特异性抗ZIKV药物或疫苗，这凸显了开发有效治疗手段的紧迫性。传统的抗病毒药物研发流程通常耗时且资源密集，对于ZIKV这类新兴虫媒病毒，商业投资兴趣有限，导致治疗方案的研发存在巨大缺口。

为了应对这一挑战，发表在《Scientific Reports》上的这项研究采用了一种多学科整合策略，将高通量体外筛选与先进的计算机模拟（in silico）分析相结合，旨在快速、高效地识别和评估潜在的抗ZIKV候选化合物。研究人员测试了一个包含348种化合物的抗病毒化合物库，这些化合物靶向多种关键病毒酶类，如HCV蛋白酶、HIV蛋白酶、整合酶和逆转录酶，库中包含多个FDA批准的药物，为老药新用提供了可能。

研究主要运用了几项关键技术方法：首先，利用Vero细胞模型和基于病毒致细胞病变效应(CPE)的结晶紫染色法进行高通量筛选，评估化合物对ZIKV (MR766株)复制的抑制能力。其次，对筛选出的活性化合物进行剂量效应(EC₅₀)和细胞毒性(CC₅₀)测定。第三，采用分子对接技术（通过AutoDock Vina/SwissDock平台）分析活性化合物与ZIKV两个关键靶点蛋白——NS5 RNA依赖性RNA聚合酶(PDB: 5WZ3)和NS2B-NS3蛋白酶复合物(PDB: 5GXJ)的相互作用。第四，对代表性化合物与NS5蛋白的结合稳定性进行了分子动力学(MD)模拟。最后，利用SwissADME和pkCSM等在线工具对先导化合物进行了药物相似性（遵循Lipinski五规则）和ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）特性预测。

2. 结果

2.1. 通过高通量筛选鉴定先导化合物

研究通过对348种化合物的筛选，发现了7种能够显著保护Vero细胞免受ZIKV诱导死亡的候选化合物。根据结晶紫染色保留情况（三次重复实验），将其分为强抑制剂（3/3孔染色）、中等抑制剂（2/3孔染色）和弱抑制剂（1/3孔染色）。头孢他辛(Cephalotaxine)、多库酯钠(Docusate Sodium)和柴胡皂苷B2(Saikosaponin B2)被鉴定为强抑制剂；NGI-1和Aloperine为中等抑制剂；AEBSF-HCl和普罗布考(Probucol)为弱抑制剂。

2.2. 先导化合物的有效浓度和细胞毒性

对三种强抑制剂进行的EC₅₀和CC₅₀测定显示，头孢他辛的EC₅₀估计约为37.5 μM，CC₅₀ > 300 μM，选择性指数(SI)约为7.5，表明其具有较好的治疗窗口。多库酯钠的EC₅₀为2.35 μM，CC₅₀为8.19 μM，SI为3.49，显示出较窄的治疗窗口，提示在有效剂量下可能存在细胞毒性风险。柴胡皂苷B2由于溶解度问题，在不同重复实验中抗病毒活性不一致，限制了其后续评估。

2.3. 受体-配体准备和活性位点预测

研究成功制备了用于分子对接的ZIKV NS5蛋白和NS2B-NS3蛋白酶的结构模型。利用SCFBio预测了关键结合口袋，并据此设定了对接网格参数，为后续精确对接奠定了基础。

2.4. 分子对接分析

分子对接结果显示，7种先导化合物与ZIKV NS5和NS2B-NS3蛋白的结合能分别在-5.02 至 -9.06 kcal/mol和-5.47 至 -8.13 kcal/mol之间。其中，柴胡皂苷B2对两个靶点均表现出最强的结合亲和力（分别为-9.06 kcal/mol和-8.13 kcal/mol），并形成了多个氢键和疏水相互作用。普罗布考对NS2B-NS3也具有强亲和力(-8.00 kcal/mol)。对接分析还揭示了一些化合物存在不利的空间位阻或相互作用，可能影响其结合稳定性。

2.5. 分子动力学模拟验证结合稳定性

为了验证对接结果并评估结合动态稳定性，研究对柴胡皂苷B2和Aloperine与NS5蛋白的结合进行了分子动力学模拟。模拟结果表明，两种配体在整个模拟过程中均能稳定地停留在结合口袋内。柴胡皂苷B2展现出比Aloperine更低的均方根偏差(RMSD)和均方根涨落(RMSF)，表明其结合更稳定，形成了更多持续性的相互作用，例如与Lys119、Glu173、Tyr287、Asp344、Cys389和His478等关键残基的相互作用。这进一步支持了柴胡皂苷B2作为有前景候选物的潜力。

2.6. 先导化合物的药物相似性和口服生物利用度

根据Lipinski五规则评估，头孢他辛、NGI-1、AEBSF-HCl和Aloperine符合规则（违反规则数≤1），提示其具有较好的口服生物利用度潜力。而柴胡皂苷B2（分子量780.98 Da，HBD=9，HBA=13）和普罗布考（LogP=8.256）则存在多项违反，表明其口服吸收可能面临挑战。生物利用度雷达图分析进一步直观地展示了各化合物在脂溶性、大小、极性、溶解度、灵活性和饱和度方面的特性。

2.7. 先导化合物的ADMET特性

ADMET预测分析提供了关于化合物药代动力学和安全性的重要信息。在吸收方面，头孢他辛、NGI-1和Aloperine表现出高肠道吸收率（>93%），而多库酯钠和柴胡皂苷B2的肠道吸收率较低（约22-25%）。柴胡皂苷B2、普罗布考和Aloperine被预测为P-糖蛋白(P-gp)底物，可能影响其吸收。在分布方面，头孢他辛和Aloperine显示出较好的血脑屏障(BBB)穿透潜力。代谢方面，多个化合物被预测为CYP3A4或CYP2D6的底物，提示可能存在药物-药物相互作用。毒性预测显示，头孢他辛、NGI-1和AEBSF-HCl可能存在肝毒性风险；柴胡皂苷B2和普罗布考可能抑制hERG II通道，存在心脏毒性潜在风险；AEBSF-HCl被预测具有AMES毒性（致突变性）。所有化合物的口服大鼠急性毒性(LD₅₀)值相对较高，表明急性口服毒性风险较低。

3. 讨论与结论

本研究通过整合高通量体外筛选和计算机模拟分析，成功鉴定出多个具有抗ZIKV活性的先导化合物。研究不仅证实了这些化合物的体外抑制效能，还通过分子对接和分子动力学模拟深入探讨了其与病毒关键蛋白（NS5和NS2B-NS3）的相互作用机制，揭示了潜在的结合位点和作用模式。药物相似性和ADMET分析则从药代动力学和安全性角度对先导化合物进行了初步评估，为后续的优化提供了方向。

综合来看，头孢他辛、NGI-1和Aloperine在体外活性、药物相似性和ADMET特性方面表现较为均衡，是值得进一步研究的候选分子。柴胡皂苷B2虽然在分子对接和动力学模拟中表现出最强的结合亲和力和稳定性，但其较差的溶解度和口服生物利用度、潜在的hERG抑制风险是其在开发过程中需要重点克服的障碍。多库酯钠活性虽强，但治疗窗口窄，细胞毒性风险高，其应用前景可能受限。

该研究的优势在于采用了多技术平台联用的策略，加速了候选化合物的发现和初步评估进程。然而，研究也存在一些局限性，例如高通量筛选依赖于半定量的CPE评分法，缺乏更精确的定量验证；分子对接和ADMET预测结果仍需通过实验（如酶活性抑制实验、表面等离子共振SPR、体外/体内药代动力学研究）进一步证实。

总之，这项研究为抗ZIKV药物的发现提供了有价值的先导化合物和丰富的机制信息，展示了计算与实验相结合的策略在抗病毒药物研发中的强大效用。所鉴定的化合物，特别是那些具有良好药代动力学特性的分子，为后续的临床前开发和结构优化奠定了坚实的基础，对应对未来可能出现的ZIKV疫情具有重要意义。