外泌体miR-20a-5p通过靶向RUNX3抑制铁死亡促进骨肉瘤顺铂耐药

《Scientific Reports》：Exosomal miR-20a-5p derived from cisplatin-resistant osteosarcoma cells promotes chemoresistance via Inhibition of ferroptosis through targeting RUNX3

本研究针对骨肉瘤顺铂耐药这一临床难题，揭示了耐药细胞来源的外泌体miR-20a-5p通过靶向RUNX3抑制铁死亡（ferroptosis）的新型耐药机制。研究人员发现耐药患者血清外泌体中miR-20a-5p显著高表达，并通过体外实验证实其可被敏感细胞摄取，通过维持线粒体形态、降低Fe2+和ROS积累、提升GSH水平等途径抑制铁死亡，从而增强化疗抵抗。该研究为逆转骨肉瘤化疗耐药提供了新的潜在靶点。

　　

在儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤——骨肉瘤，尽管在手术联合化疗等综合治疗方面取得了显著进步，但过去几十年里患者的长期生存率依然停滞不前。特别是对于发生转移或复发的患者，预后极差，其核心障碍在于肿瘤细胞对化疗药物产生先天或获得性耐药。顺铂作为铂类DNA交联剂，是骨肉瘤化疗方案的基石药物，然而耐药性的出现严重制约了其疗效，探索其内在分子机制并开发新的应对策略迫在眉睫。

近年来，细胞外囊泡，尤其是外泌体，作为细胞间通信的关键媒介，在肿瘤进展和治疗抵抗中的作用日益凸显。这些直径30-150纳米的脂质双层囊泡携带蛋白质、脂质、mRNA以及microRNA（miRNA）等活性物质，如同微小的“通信包裹”，在体液中穿梭，将信息传递给受体细胞，重塑其生物学行为。在化疗耐药背景下，外泌体miRNA被证实能够重编程敏感细胞，使其获得耐药表型。与此同时，一种铁依赖性的、非凋亡形式的程序性细胞死亡——铁死亡（ferroptosis），因其在肿瘤化疗反应中的重要作用而备受关注。铁死亡的特征是活性氧（ROS）积累和致命的脂质过氧化，其过程受细胞内铁代谢和谷胱甘肽（GSH）、GPX4等抗氧化系统的精细调控。研究表明，抑制铁死亡可能导致多种肿瘤模型产生顺铂耐药。然而，外泌体miRNA与铁死亡在骨肉瘤化疗耐药中的相互作用，仍是一个未被充分探索的关键领域。

发表在《Scientific Reports》上的这项研究，旨在揭示外泌体miR-20a-5p是否通过抑制铁死亡来促进骨肉瘤的顺铂耐药，并深入探索其作用靶点，为克服耐药提供新的分子靶点。

为开展研究，作者运用了几项关键技术：首先，收集了5例顺铂耐药和5例顺铂敏感骨肉瘤患者的血清样本，采用沉淀法分离外泌体，并通过高通量测序筛选差异表达的miRNA。其次，通过间歇性诱导法成功构建了顺铂耐药的HOS细胞株（HOS-DDP）。再者，利用超速离心法分离细胞培养上清液中的外泌体，并通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析和Western blot（蛋白免疫印迹）对其进行鉴定。细胞功能实验方面，采用CCK-8（细胞计数试剂盒-8）法检测细胞活力和半数抑制浓度（IC₅₀），使用流式细胞术分析细胞周期和ROS水平，并利用特异性荧光探针（如FerroOrange）检测细胞内Fe²⁺水平。分子机制探究中，通过生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验验证miR-20a-5p与靶基因的相互作用，并通过qRT-PCR（实时荧光定量PCR）和Western blot检测基因和蛋白表达水平。

3.1 顺铂耐药患者血清来源的外泌体miR-20a-5p表达上调

研究人员首先从患者血清中成功分离出外泌体。透射电镜显示典型的碟形膜泡结构，纳米颗粒追踪分析表明粒径主要分布在50-100纳米，Western blot证实外泌体标志蛋白TSG101和CD63高表达。

对血清外泌体进行miRNA高通量测序，主成分分析显示耐药组与敏感组明显分离。差异表达分析鉴定出33个差异miRNA（18个上调，15个下调）。KEGG通路富集分析提示这些miRNA显著富集于铁死亡等通路。进一步分析显示，miR-20a-5p与铁死亡通路关联最紧密，其靶基因参与调控铁死亡的数量最多。qRT-PCR验证了耐药组血清外泌体中miR-20a-5p的表达水平显著高于敏感组。因此，研究聚焦于外泌体miR-20a-5p。

3.2 顺铂耐药骨肉瘤细胞来源的外泌体miR-20a-5p可通过调控铁死亡来调节顺铂耐药

成功构建顺铂耐药HOS细胞株（HOS-DDP），其IC₅₀值是亲本HOS细胞的4.6倍，且在顺铂处理下增殖活性更强，细胞周期分布显示S期和G2/M期细胞比例增加。从HOS-DDP细胞培养上清中分离出的外泌体具有典型特征。示踪实验证实HOS细胞能够内吞这些外泌体。与HOS-DDP细胞外泌体共培养后，HOS细胞内miR-20a-5p表达水平显著升高，细胞存活率提高，对顺铂的IC₅₀值也显著上升，表明获得了耐药性。

为探究铁死亡的作用，研究人员检测了相关指标。电镜观察发现，在1.2μg/mL顺铂处理下，对照组HOS细胞线粒体出现肿胀、膜结构不完整、嵴减少等铁死亡典型形态变化，而与HOS-DDP外泌体共培养的HOS细胞线粒体形态保持正常。此外，共培养细胞在顺铂处理后，细胞内GSH水平下降幅度较小，Fe²⁺积累和ROS水平升高幅度也显著低于对照组，而总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性保持较高水平。使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1处理后，所有顺铂处理组的细胞存活率均提高，但在1.2μg/mL顺铂浓度下，共培养组的存活率仍显著高于对照组，提示外泌体可能还通过其他机制赋予耐药性。

3.3 过表达外泌体miR-20a-5p可进一步抑制HOS细胞铁死亡并促进顺铂耐药

为确证是外泌体miR-20a-5p本身在起作用，研究者在HOS-DDP细胞中分别上调和下调miR-20a-5p表达，然后提取其外泌体与HOS细胞共培养。结果显示，与转染抑制剂（抑制miR-20a-5p）的HOS-DDP细胞来源的外泌体（inhibitorexo）共培养的HOS细胞，在顺铂处理后出现明显的线粒体嵴减少等铁死亡形态，且GSH水平更低，Fe²⁺积累和ROS水平更高，T-SOD活性更低。相反，与过表达miR-20a-5p的HOS-DDP细胞来源的外泌体（mimicsexo）共培养，则能更好地维持线粒体形态，减轻铁死亡相关指标的变化。这表明外泌体miR-20a-5p的表达水平直接调控HOS细胞对顺铂诱导的铁死亡的敏感性。

3.4 外泌体miR-20a-5p结合RUNX3，参与抑制铁死亡并促进HOS细胞顺铂耐药

通过生物信息学数据库交叉预测，发现RUNX3是miR-20a-5p的潜在靶基因。免疫组化显示RUNX3在骨肉瘤组织中表达降低，且其低表达与患者不良预后相关。双荧光素酶报告基因实验证实miR-20a-5p可直接结合RUNX3的3'非翻译区（3'UTR）并抑制其活性。

为验证miR-20a-5p通过靶向RUNX3调控铁死亡，研究者在HOS细胞中过表达RUNX3（HOSOE），然后分别与mimicsexo和NCexo（阴性对照外泌体）共培养。结果显示，过表达RUNX3本身可促进铁死亡，表现为在顺铂处理后，HOSOE细胞相比对照（HOSNc）细胞GSH水平更低，Fe²⁺积累和ROS水平更高，T-SOD活性更低。然而，当HOSOE细胞与富含miR-20a-5p的mimicsexo共培养后，这种由RUNX3过表达所促进的铁死亡效应被显著逆转，相关指标趋向于抵抗铁死亡。这直接证明了外泌体miR-20a-5p是通过抑制RUNX3来发挥其抗铁死亡和促耐药作用的。

结论与讨论

本研究系统阐明了顺铂耐药的骨肉瘤细胞通过释放富含miR-20a-5p的外泌体，将耐药特性传递给敏感细胞的分子机制。这些外泌体被敏感细胞内化后，其携带的miR-20a-5p直接靶向并抑制肿瘤抑制因子RUNX3的表达，进而削弱了顺铂诱导的铁死亡过程。具体表现为维持了线粒体结构完整性，减少了铁离子积累和活性氧爆发，提升了谷胱甘肽水平和总超氧化物歧化酶活性，从而帮助细胞在化疗压力下存活。逆转实验证实，恢复RUNX3表达可以克服miR-20a-5p介导的耐药表型。

该研究的创新性在于首次将外泌体miRNA、铁死亡和骨肉瘤顺铂耐药三者紧密联系起来，并明确了miR-20a-5p/RUNX3轴是这一过程的核心环节。这不仅深化了对肿瘤微环境中细胞间通信如何影响治疗反应的理解，也为克服骨肉瘤化疗耐药提供了新的潜在靶点——干预外泌体miR-20a-5p的递送或其与RUNX3的相互作用，可能成为增敏顺铂治疗的新策略。当然，研究也存在局限性，例如体内实验验证的缺乏，以及RUNX3下游调控铁死亡的具体通路仍需进一步探索。此外，铁死亡抑制剂处理后共培养组仍显示生存优势，提示耐药外泌体可能还携带了其他赋予耐药性的物质，这为未来研究留下了空间。总之，该研究为理解骨肉瘤耐药机制提供了重要新知，并为开发联合治疗策略奠定了理论基础。