艾曲波帕乙醇胺通过调控多凋亡通路诱导人乳腺癌与肝癌细胞凋亡的作用及机制研究

《Scientific Reports》：Eltrombopag olamine induces apoptosis in human breast adenocarcinoma and hepatocellular carcinoma cells through modulation of multiple apoptotic pathways

本研究针对现有癌症治疗耐药性与副作用问题，探讨了已获批药物艾曲波帕乙醇胺（Eltrombopag olamine）的抗癌潜力。研究人员发现该药物能通过剂量依赖性方式抑制MCF-7和SMMC-7721癌细胞增殖，诱导细胞凋亡与周期阻滞，并调控FAS、TP53、EGFR、TNF-α等多条信号通路。分子对接证实其与关键蛋白结合，表明艾曲波帕乙醇胺有望成为治疗乳腺癌和肝癌的多靶点候选药物，为药物重定位（drug repurposing）提供了新策略。

　　

癌症至今仍是全球性的健康挑战，尽管治疗方法不断进步，但现有治疗手段的局限性，如耐药性的产生和严重的副作用，促使科学家们不断寻找更有效、更安全的治疗策略。在这种背景下，药物重定位（drug repurposing）——即挖掘已获批药物的新适应症——因其研发周期短、安全性已知而成为一种极具吸引力的途径。艾曲波帕乙醇胺（Eltrombopag olamine）是一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的血小板生成素受体激动剂，主要用于治疗慢性免疫性血小板减少症和再生障碍性贫血。除了促进血小板生成，研究表明它还具有铁螯合特性，并在一些白血病细胞中显示出抗肿瘤活性。先前的研究多集中于其铁螯合或抑制HuR蛋白的能力，而对于它如何精确调控癌细胞凋亡的分子机制，尤其是对关键凋亡和生存相关基因表达模式的影响，尚缺乏深入探讨。

为了填补这一空白，由Syed Rashel Kabir和Mohammad Taufiq Alam领导的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们首次系统地探讨了艾曲波帕乙醇胺在两种重要的人类癌细胞系——MCF-7（乳腺癌腺癌）和SMMC-7721（肝细胞癌）——中诱导凋亡的分子机制。研究旨在评估该药物抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期以及调控多条凋亡和促生存信号通路的能力。

为了回答上述科学问题，研究人员运用了多种细胞和分子生物学技术。关键的实验方法包括：MTT法检测细胞活力并计算半数抑制浓度（IC₅₀）；Hoechst 33342染色和荧光显微镜观察细胞核形态以鉴定凋亡；FITC-annexin V/PI双染结合荧光显微镜和流式细胞术定量分析早期/晚期凋亡和坏死细胞；流式细胞术进行细胞周期分析；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测多种凋亡相关基因（如FAS, TP53, BAX, TNFα, Cytochrome-C, EGFR, ERK, STAT3, MAPK1, NOTCH1, PARP1, WNT1）的表达水平；使用caspase-3、-8、-9抑制剂探讨caspase酶在凋亡过程中的作用；以及分子对接模拟（molecular docking）预测艾曲波帕与关键蛋白（EGFR, FAS, TP53, TNFα）之间的相互作用。研究所用的细胞系（MCF-7, SMMC-7721, HEK293T）均采购自ATCC。

结果

艾曲波帕乙醇胺的体外抗增殖活性

研究首先评估了艾曲波帕乙醇胺对癌细胞和非癌细胞的毒性作用。结果表明，该药物对MCF-7和SMMC-7721细胞的增殖均产生剂量依赖性的抑制作用。计算得到的IC₅₀值分别为31 μg/mL（MCF-7）、154 μg/mL（SMMC-7721）和127 μg/mL（非癌HEK293T细胞）。这意味着MCF-7细胞对药物的敏感性最高，且药物对癌细胞的毒性在一定程度上优于正常细胞，显示出一定的选择性。

Caspase酶参与艾曲波帕乙醇胺的细胞毒性

为了探究凋亡是否依赖于caspase酶通路，研究者在加入艾曲波帕乙醇胺的同时，分别使用了caspase-3、caspase-8和caspase-9的抑制剂。结果发现，这三种抑制剂均能显著减弱艾曲波帕乙醇胺对MCF-7和SMMC-7721细胞的杀伤作用。例如，在MCF-7细胞中，caspase-3、-8、-9抑制剂分别使药物引起的增殖抑制率从44%降至26%、30%和31%。这强有力地证明了caspase依赖性凋亡通路在药物作用中扮演了关键角色。

Hoechst 33342染色检测细胞形态学变化

通过Hoechst 33342染料对细胞核进行染色，并在荧光显微镜下观察，研究人员发现了典型的凋亡形态学特征。与对照组细胞均匀、弥散的蓝色荧光相比，经艾曲波帕乙醇胺处理后的MCF-7和SMMC-7721细胞均出现了明显的核固缩（染色质凝聚）和核碎裂现象，这是细胞发生凋亡的确凿证据。

FITC-annexin V/PI染色检测早期和晚期凋亡

利用annexin V（可结合于凋亡细胞外翻的磷脂酰丝氨酸）和碘化丙啶（PI，可进入膜破损的坏死或晚期凋亡细胞）进行双染，可以区分不同状态的细胞。荧光显微镜观察显示，药物处理后，两种细胞系中晚期凋亡细胞的数量均显著增加。此外，在SMMC-7721细胞中还观察到了早期凋亡细胞的增多。

流式细胞术检测凋亡和坏死性死亡细胞

流式细胞术提供了更精确的定量数据。对于MCF-7细胞，药物处理导致晚期凋亡细胞比例从3.14%急剧上升至59.23%，而早期凋亡和坏死细胞比例变化不大，表明MCF-7细胞主要通过晚期凋亡途径死亡。相比之下，SMMC-7721细胞在药物作用后，不仅晚期凋亡细胞从5.12%增至21.21%，坏死细胞也从9.74%上升至29.29%，提示该细胞系同时经历了凋亡和坏死两种死亡方式。

基因表达水平的改变

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果揭示了艾曲波帕乙醇胺对多种基因表达的深刻影响。在MCF-7细胞中，促凋亡基因FAS、TP53、BAX、TNFα和Cytochrome-C的表达上调，而促生存信号通路相关的基因EGFR和ERK的表达则被下调，NOTCH1基因表达无显著变化。在SMMC-7721细胞中，促凋亡基因TP53和BAX同样上调，而一系列促癌和生存相关基因，包括STAT3、MAPK1、NOTCH1、PARP1、EGFR和ERK，均显著下调。尤为值得注意的是，在两种细胞系中，WNT1基因的表达几乎被完全废除。这些变化共同指向了药物通过调控多条信号通路（包括线粒体凋亡通路、死亡受体通路、EGFR-MAPK1-ERK通路和WNT信号通路）来诱导细胞凋亡。

细胞周期阻滞

细胞周期分析显示，艾曲波帕乙醇胺处理引起了两种细胞系的S期阻滞。在MCF-7细胞中，S期细胞比例从18.14%增加至21.61%；在SMMC-7721细胞中，S期细胞从7.56%增加至11.54%。S期是DNA合成期，S期阻滞通常与DNA复制应激或合成抑制有关，这为凋亡程序的启动提供了时间。此外，在SMMC-7721细胞中，代表凋亡细胞群的亚G1期细胞比例从1.23%显著增加至8.56%，进一步证实了药物诱导的细胞死亡。

计算机模拟研究（In silico study）

分子对接模拟结果显示，艾曲波帕与所选的关键蛋白均能稳定结合。其中，与表皮生长因子受体（EGFR）的结合能最低（-9.3 kcal/mol），表明结合最稳定，主要通过氢键与Thr761、Val762、Gly833和Glu734等氨基酸残基相互作用。与FAS、TP53和TNFα蛋白的结合能分别为-8.9 kcal/mol、-7.8 kcal/mol和-7.4 kcal/mol，也显示出良好的结合潜力，并通过氢键、Pi-烷基等多种相互作用与蛋白活性位点结合。这为艾曲波帕直接作用于这些信号蛋白，从而调控下游凋亡通路提供了结构层面的支持。

讨论与结论

本研究系统阐明了艾曲波帕乙醇胺在体外对人类乳腺癌MCF-7和肝癌SMMC-7721细胞具有显著的抗增殖和促凋亡活性。其作用机制是多靶点、多通路的。一方面，它通过上调TP53和BAX，促进线粒体细胞色素C（Cytochrome-C）的释放，激活caspase-9和caspase-3，从而启动内在凋亡通路；同时，通过上调FAS和TNFα，可能激活死亡受体通路，进而激活caspase-8，并交叉放大caspase-3的活化。另一方面，药物显著抑制了多个关键的促生存信号通路，包括EGFR-MAPK1-ERK通路、STAT3信号以及WNT1信号。特别是对EGFR和WNT1信号的双重抑制，由同一个非 oncology 来源的已上市药物实现，实属罕见，这可能赋予其克服单通路靶向药物耐药性的潜力。

细胞周期S期的阻滞以及SMMC-7721细胞中出现的亚G1期峰增高，与药物诱导的DNA损伤和后续的凋亡进程相符。流式细胞术和基因表达谱的差异（MCF-7以凋亡为主，SMMC-7721出现凋亡与坏死并存）提示艾曲波帕乙醇胺的作用机制可能具有细胞类型特异性，这对其在不同癌症类型中的治疗策略具有启示意义。分子对接结果则从理论上支持了艾曲波帕可直接与EGFR、FAS、TP53、TNFα等靶点相互作用。

综上所述，这项研究不仅证实了艾曲波帕乙醇胺作为一种已获批药物在乳腺癌和肝癌治疗中的潜在应用价值，更重要的是，它深入揭示了其通过调控错综复杂的信号网络诱导癌细胞凋亡的分子蓝图。这些发现为将艾曲波帕乙醇胺重新定位为一种多靶点抗癌候选药物提供了强有力的临床前证据，并为后续的体内实验和可能的联合用药研究奠定了坚实的基础。尽管本研究存在局限性（如仅为体外实验，未探索联合用药），但它无疑为开发新的癌症治疗策略开辟了一条富有前景的道路。