TIR结构域蛋白C（TcpC）作为先天免疫检查点的双重调节因子：在尿路致病性大肠杆菌感染中的刺激与抑制功能

《Scientific Reports》：TIR-domain-containing protein C as modulator of innate immune checkpoints

本研究针对尿路致病性大肠杆菌（UPEC）毒力因子TcpC如何调控宿主先天免疫应答这一关键科学问题，系统探讨了TcpC在不同感染环境下对TLR4/MyD88信号通路和NLRP3炎症小体的双重调节作用。研究人员通过感染多种人源细胞模型（包括膀胱上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞等），结合可诱导表达系统和细菌培养上清转移实验，发现TcpC在活菌感染时增强促炎细胞因子分泌，而在纯化PAMP刺激时则发挥抑制作用。这一发现揭示了TcpC作为先天免疫检查点调节因子的环境依赖性功能，为理解UPEC的免疫逃逸机制提供了新视角。

　　

在微生物与宿主的永恒军备竞赛中，病原菌不断进化出精妙的策略来操纵宿主的免疫防御系统。尿路致病性大肠杆菌（UPEC）作为尿路感染（UTI）的主要病原体，其毒力因子TcpC（TIR结构域蛋白C）正是这样一个"双面间谍"——它既能抑制又能增强宿主的免疫应答，具体表现取决于感染的环境条件。这一发现挑战了我们对细菌免疫调节蛋白功能的传统认知，也为理解UTI的发病机制提供了新的视角。

以往的研究表明，TcpC通过其TIR（Toll/白介素-1受体）结构域与宿主免疫信号通路的关键组件（如TLR4、MyD88和NLRP3）相互作用，从而抑制促炎细胞因子的产生。然而，矛盾的是，在动物感染模型中，表达TcpC的UPEC菌株CFT073却能引起更强烈的炎症反应和肾脏脓肿形成。这种看似矛盾的现象引发了研究人员的深入思考：TcpC到底是如何调控宿主免疫的？其功能是否受到特定环境因素的影响？

为了解答这些疑问，Heine等人发表在《Scientific Reports》上的研究系统探讨了TcpC在不同细胞类型和刺激条件下的免疫调节功能。研究人员发现，TcpC的功能具有显著的情境依赖性：在活菌感染过程中，它增强宿主的免疫应答；而在纯化的病原体相关分子模式（PAMP）刺激时，它则发挥抑制作用。这一发现不仅解决了先前研究中的矛盾结果，还揭示了细菌免疫调节蛋白功能的新维度。

研究中采用的关键技术方法包括：多种人源细胞系（膀胱上皮细胞T24/83、肾 proximal tube上皮细胞HK-2、单核细胞THP-1）和原代细胞（外周血单核细胞PBMC、CD14⁺单核细胞）的感染模型；CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR4和MyD88缺陷型细胞系；细菌培养上清转移实验；可诱导表达系统调控TcpC表达水平；以及酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子分泌。研究还涉及单核细胞向巨噬细胞的分化和极化（M0、M1、M2表型），并使用健康 donor来源的血液样本（经伦理委员会批准）。

TcpC的刺激作用

研究人员首先验证了TcpC在不同感染复数（MOI）下对先天免疫应答的影响。与预期相反，感染人膀胱上皮细胞系T24/83时，tcpC缺陷型菌株CFT073△tcpC诱导的IL-6和TNFα分泌显著低于野生型CFT073或回补菌株。通过CRISPR/Cas9技术构建的tlr4和myd88缺陷型T24/83细胞进一步证实，CFT073的免疫刺激主要依赖TLR4-MyD88信号通路，而TcpC的增强作用在myd88缺陷型细胞中仍然存在，表明其作用机制可能涉及更复杂的调控网络。

单核细胞向M0巨噬细胞分化减弱TcpC的影响

研究团队随后探讨了TcpC对免疫细胞的影响。在单核细胞系THP-1、原代PBMC和CD14⁺单核细胞中，TcpC均显著增强了CFT073诱导的IL-1β和TNFα分泌（存在供体间差异）。然而，当这些细胞分化为M0巨噬细胞后，TcpC的增强效应明显减弱或消失。这一现象可能与巨噬细胞对内毒素的敏感性远高于单核细胞有关，提示细胞分化状态显著影响其对TcpC的应答。

THP-1细胞向M1或M2巨噬细胞的极化

研究人员进一步研究了巨噬细胞极化状态对TcpC功能的影响。M1型巨噬细胞（促炎表型）感染CFT073后，TcpC对IL-1β分泌的影响不显著，但增强了TNFα和IL-6的分泌。令人意外的是，M2型巨噬细胞（抗炎表型）对CFT073感染几乎无应答，尽管它们仍能响应纯化内毒素的刺激。这表明细菌全菌感染与纯化PAMP的免疫刺激机制存在本质差异。

TcpC增强的先天免疫刺激取决于细菌复制与TcpC表达的比例

为了深入探索TcpC的剂量效应，研究人员构建了TcpC的脱水四环素（Atc）诱导表达系统。结果显示，TcpC表达水平与细菌复制能力呈负相关，可能与其NAD⁺消耗活性有关。感染实验表明，中等程度的TcpC诱导（5-15 ng/ml Atc）显著增强THP-1细胞的IL-1β和TNFα分泌，而高浓度诱导（25 ng/ml Atc）则因强烈抑制细菌复制而减弱细胞因子应答。这表明TcpC的免疫调节效果取决于其表达水平与细菌PAMP数量的相对比例。

TcpC抑制内毒素加ATP驱动的先天免疫应答

通过细菌培养上清转移实验，研究人员发现含TcpC的上清可抑制内毒素加ATP刺激的THP-1细胞的TNFα和IL-1β分泌。这种抑制效应依赖于TcpC的TIR结构域，且仅在含胎牛血清（FCS）的培养条件下出现，提示血清成分可能影响TcpC的分泌或稳定性。这一发现揭示了TcpC在细胞外环境中的免疫抑制功能。

TcpC的TIR结构域以FCS依赖性方式抑制细胞因子分泌

进一步实验证实，全长TcpC而非其N端片段（1-183）介导了上述抑制效应。值得注意的是，TcpC的抑制活性严格依赖于培养条件中的FCS，尽管FCS不影响TcpC在细菌胞质中的表达水平。这可能意味着FCS影响TcpC的分泌、稳定性或其与宿主分子的相互作用。

研究的讨论部分整合了这些发现，指出TcpC作为先天免疫检查点的双重功能：在活菌感染环境下增强免疫应答，而在纯化PAMP刺激时发挥抑制作用。这种情境依赖性可能源于TcpC表达水平、细菌负荷与宿主细胞状态之间的复杂相互作用。值得注意的是，TcpC的免疫调节效果随单核细胞向巨噬细胞的分化而减弱，表明宿主细胞的成熟和极化状态是决定TcpC功能的关键因素。

这项研究的重要意义在于揭示了细菌免疫调节蛋白功能的复杂性，挑战了"毒力因子必然抑制免疫"的简化观点。TcpC的双重功能可能有助于解释UPEC感染中的矛盾现象：初期增强炎症以建立感染生态位，后期抑制免疫以维持持久感染。这些发现不仅深化了我们对宿主-病原体相互作用的理解，也为开发针对UTI的新治疗策略提供了理论基础。未来研究需进一步阐明TcpC功能转换的分子机制及其在体内的病理生理意义。