内在无序蛋白POSH与Rac1结合过程中的层级折叠机制研究

《Nature Communications》：Hierarchical folding-upon-binding of an intrinsically disordered protein

本研究针对内在无序蛋白（IDP）通过扩展区域（而非短线性基序）进行折叠-结合这一尚未明晰的机制，以信号效应蛋白POSH与小GTP酶Rac1为模型，结合核磁共振波谱（NMR）与X射线晶体学，揭示了POSH通过两个结构不同的折叠中间态，以严格层级顺序实现从完全无序到高度有序结构的转变。该工作阐明了长序列IDP的结合诱导折叠轨迹，为靶向IDP折叠中间态以开发治疗策略提供了新思路。

　　

在生命活动的复杂交响曲中，蛋白质扮演着至关重要的角色。传统观点认为，蛋白质的功能依赖于其独特且稳定的三维结构。然而，人类蛋白质组中约有40%的成员挑战了这一范式，它们被称为内在无序蛋白（Intrinsically Disordered Proteins, IDPs）。这些蛋白质不像结构蛋白那样拥有固定的形状，而是以动态、不断变化的构象集合体存在，并在细胞信号转导、转录调控等关键过程中发挥重要作用。IDPs的功能失调与癌症、神经退行性疾病等多种疾病密切相关，因此被视为极具潜力的下一代药物靶点。

许多IDPs通过短线性基序（Short Linear Motifs, SLiMs，通常为5-15个氨基酸）与它们的伴侣分子结合，并在结合过程中折叠成特定结构。对于这类“折叠-结合”机制，科学家们已有较多了解。然而，仍有相当一部分IDP并不遵循这一模式，它们利用更长的序列区域（包含多个分子识别元件）与伴侣结合。对于这些IDP，其结合的具体路径、可能存在的折叠中间态的结构特征以及驱动这种广泛相互作用的 thermodynamic（热力学）力量，仍然知之甚少。这阻碍了我们对IDP功能调控的深入理解以及针对IDP复合物的药物开发。

为了解决这一问题，由Malene Ringkj?bing Jensen、Andrés Palencia和Guillaume Bouvignies共同领导的研究团队，在《Nature Communications》上发表了一项重要研究。他们以 disordered 的信号效应蛋白POSH（Plenty Of SH3s）和小GTP酶Rac1之间的相互作用为模型，深入探究了长序列IDP的“折叠-结合”机制。研究发现，POSH采用了一种前所未有的层级折叠机制，逐步从完全无序的状态转变为与Rac1紧密结合的高度有序结构。

为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：核磁共振波谱（NMR，用于研究溶液状态下蛋白质的结构、动力学和相互作用，包括化学交换饱和转移CEST实验以探测不可见的结合态）、X射线晶体学（用于高分辨率解析蛋白质复合物的三维结构）、等温滴定量热法（ITC，用于测定结合的热力学参数，如亲和力、焓变和熵变）以及蛋白质表达纯化（使用大肠杆菌系统表达并纯化所需的重组蛋白样品，包括Rac1和不同长度的POSH片段）。

POSH包含非典型CRIB基序并与Rac1发生广泛相互作用

Rac1是Rho家族小GTP酶的一员，作为分子开关在细胞信号转导中起核心作用。它通过结合GDP（失活态）或GTP（活化态）来切换其功能状态。活化的Rac1（GTP结合形式）能够识别效应蛋白上的Cdc42/Rac1-interactive binding（CRIB）基序，从而激活下游信号通路。POSH是一个支架蛋白，已知通过其第二和第三个SH3结构域之间的无序区域（残基260-445）与Rac1相互作用。然而，分析发现POSH仅包含一个部分保守的CRIB基序，暗示其可能采用非典型的结合模式。

研究人员首先通过NMR确认，游离状态的POSH结合区域完全缺乏可辨别的二级结构，呈现典型的无序特征。滴定实验表明，POSH与Rac1的结合在NMR化学位移时间尺度上属于慢交换过程。通过测量15N R1ρ弛豫速率和15N CEST实验，他们确定Rac1结合并诱导了POSH上一个长达50个氨基酸的区域（残基322-372）发生折叠，该区域包含两个不同的分子识别元件（MRE1和MRE2），中间由柔性连接区隔开。13C‘ CEST实验进一步提示，结合后MRE1可能形成β-链和α-螺旋，而MRE2可能形成β-链结构。

ITC揭示折叠驱动的热力学特征

为了解结合过程的热力学驱动力，研究人员进行了ITC实验。结果显示，POSH与Rac1的结合亲和力处于微摩尔级别（K_d在5°C至35°C间为21至46 μM），并伴随着显著的负热容变化（ΔC_p = -2.8 kJ·mol^-1·K^-1），这强烈表明结合过程中发生了广泛的折叠和疏水表面的埋藏。通过Spolar-Record分析对熵贡献进行剖析，发现POSH折叠所带来的构象熵惩罚被蛋白质表面去溶剂化（脱水）所补偿，使得结合的总熵变是有利的。估算表明，约有40个POSH残基在结合过程中发生折叠，这与NMR确定的结合区域大小高度一致。

晶体结构揭示POSH以腰带样构象包裹Rac1

为了在原子水平上看清复合物的结构，研究团队成功解析了Rac1与POSH复合物的晶体结构，分辨率高达1.25 ?。结构清晰地显示，POSH确实发生了广泛的折叠，其结合区域像一条腰带一样缠绕在Rac1分子表面，覆盖了Rac1约20%的表面积。MRE1形成一段延伸构象，接着是一个短的β-链和一个α-螺旋；MRE2则形成一个β-发夹结构，这与之前的CEST数据推测一致。这与之前报道的其他GTP酶-效应器复合物的结构截然不同。结构细节表明，POSH通过其部分CRIB基序中的疏水残基嵌入Rac1表面的一个疏水空腔中，并通过大量氢键和疏水相互作用稳定结合。值得注意的是，MRE2部分覆盖在MRE1之上，两者之间存在相互作用，暗示MRE2的结合可能依赖于MRE1的正确折叠。基于人工智能的结构预测工具AlphaFold2和AlphaFold3未能准确预测MRE2的构象，甚至对MRE1的预测也存在偏差，凸显了实验结构解析对于IDP复合物的重要性。

NMR动力学分析证实层级折叠机制

最关键的问题是，POSH是如何一步步从无序状态折叠成这个复杂结构的？是MRE1和MRE2同时折叠，还是有先后顺序？为了回答这个问题，研究人员进行了更深入的NMR动力学分析。对CRIB基序进行点突变后，POSH完全丧失了与Rac1结合的能力，证明MRE1的初始锚定是必不可少的，且MRE2无法独立结合Rac1，这支持了层级折叠的假设。

随后，他们利用15N CEST实验，并结合不同强度的B1场，来探测NMR谱图上“不可见”的Rac1结合态下的POSH构象。数据分析比较了两种交换模型：一种是线性3态交换模型（自由态F → 中间态B → 完全结合态C），另一种是线性4态交换模型（自由态F → 中间态A（CRIB锚定态）→ 中间态B（MRE1折叠态）→ 完全结合态C）。结果表明，4态模型能显著更好地拟合所有实验数据，从而清晰地描绘出POSH的层级折叠路径：

1. 1.
   初始锚定（F → A）： 结合始于POSH的部分CRIB基序与Rac1的Switch I环区结合，形成第一个中间态（A）。在此状态下，仅CRIB基序和MRE1的一小段β-链被初步固定，MRE1的其余部分和整个MRE2仍保持无序。这一步的结合和解离速率都较慢。
2. 2.
   MRE1折叠（A → B）： 随后，MRE1的α-螺旋在秒级时间尺度上发生折叠，形成第二个中间态（B）。令人惊讶的是，在此状态下，尚未折叠的MRE2并非完全自由无序，而是表现出明显的化学位移扰动，表明它已经“坍塌”在Rac1表面，动态地采样着具有结合能力的构象，为最终折叠做准备。
3. 3.
   MRE2折叠（B → C）： 最后，MRE2折叠成其最终的β-发夹结构（C），完成整个结合过程。MRE2在中间态B中对结合相容构象的动态采样，促进了其最终的快速折叠。

这项研究通过高分辨率的结构生物学和生物物理学手段，首次在原子水平上揭示了一种由内在无序蛋白（IDP）执行的严格层级折叠-结合机制。POSH与Rac1的结合并非一蹴而就，而是遵循着CRIB基序锚定、MRE1折叠、MRE2折叠这一不可颠倒的顺序。这种机制的排他性确保了结合的精确性，可能在对时序有严格要求的信号传导和分子组装过程中具有重要的调控意义。

与典型的GTP酶-效应器相互作用相比，POSH与Rac1的亲和力较弱，这可能与其非典型CRIB基序以及结合过程中付出的较大构象熵代价有关。这种较弱的、瞬时的相互作用可能更有利于POSH作为支架蛋白动态地调控信号通路，而不至于长时间“扣押”Rac1。

更重要的是，这项工作深化了我们对IDP结合机制的理解，表明除了常见的短线性基序和“dock-and-coalesce”模型外，层级折叠是一种重要的替代机制。研究揭示的明确折叠路径和中间态结构，为针对难以成药的IDP开发干预策略提供了新的可能性。例如，小分子或肽类化合物或许可以特异性地稳定或破坏某个折叠中间态，从而精确调控IDP的功能。此外，该研究提供的原子级别细节将有助于改进IDP复合物的结构预测算法。总之，这项研究不仅解答了一个基础生物学问题，也为未来针对IDP相关疾病的治疗开发开辟了新的视角。