TUBB基因突变通过破坏纤毛发生导致纤毛病样表型的新机制

《Nature Communications》：Mutations in the β-tubulin TUBB impair ciliogenesis and are associated with ciliopathy-like phenotypes

本研究针对一例同时表现出纤毛病和微管蛋白病特征的患者，通过全基因组测序发现其TUBB基因存在G308S错义突变。研究人员利用患者来源细胞和基因编辑细胞系，首次证实β-微管蛋白突变可通过影响微管动力学和结构而损害纤毛发生，并在小鼠模型中观察到小脑和肾脏纤毛减少。该研究建立了微管蛋白突变与神经发育纤毛病之间的直接联系，为部分微管蛋白病患者提供了新的致病机制解释。

　　

在遗传性神经系统疾病研究领域，微管蛋白病和神经发育纤毛病一直被视为两类独立的疾病实体。微管蛋白病主要由微管基本组成单元——微管蛋白的突变引起，表现为大脑结构异常等神经发育缺陷；而神经发育纤毛病则因原发性纤毛功能障碍导致，典型代表如Joubert综合征(JS)和Meckel综合征(MKS)。尽管微管作为纤毛轴丝的核心结构成分，其与纤毛发生的密切关系在细胞生物学中早已明确，但微管蛋白突变是否直接导致纤毛病样表型，长期以来缺乏直接证据。

这一知识空白使得许多临床表现复杂的患者难以获得精准诊断。特别是当患者同时表现出微管蛋白病和纤毛病的特征时，其潜在的遗传病因和分子机制往往成谜。正是为了解决这一临床难题，由Antonio Mollica和Safia Omer等研究人员组成的团队开展了这项创新性研究，他们的成果发表在《Nature Communications》杂志上。

研究人员从一例表现为神经发育迟缓、共济失调、眼动失用等复杂症状的男性患者入手。脑磁共振成像(MRI)显示患者同时存在Joubert综合征典型的“磨牙征”(molar tooth sign, MTS)和微管蛋白病相关的软性特征，如小脑半球发育不良和尾状核异常。这种罕见的临床表现组合提示可能存在新的致病机制。

通过全基因组测序，研究团队在患者中发现了一个de novo杂合错义突变——TUBB基因c.922G>A(p.G308S)。TUBB编码β-微管蛋白，是大脑发育过程中表达最丰富的β-微管蛋白异型之一。序列分析显示G308在从酵母到灵长类的所有TUBB直系同源物中高度保守，且位于β-片层8之前的尖锐转角处，其后跟随的结构上重要的精氨酸残基(R309)。

为了验证该突变的致病性，研究团队开展了系列实验。他们首先利用患者来源的皮肤成纤维细胞进行研究发现，与对照相比，患者细胞的纤毛形成频率显著降低约30%，而纤毛长度正常，表明存在纤毛发生缺陷。随后，他们通过prime editing技术在hTERT-RPE1细胞中构建了TUBB G308S杂合细胞模型，完美模拟了患者的基因型。

关键实验技术方面，研究主要采用了：患者及对照来源的原代皮肤成纤维细胞培养与纤毛分析；prime editing基因编辑技术构建等基因细胞系；全基因组测序与生物信息学分析；免疫荧光染色与共聚焦显微镜分析微管网络和纤毛结构；活细胞成像追踪EB1-GFP彗星运动分析微管动力学；蛋白质结构模拟与稳定性预测；以及通过胚胎干细胞打靶和胚胎聚集技术构建嵌合小鼠模型进行体内验证。

TUBB G308S突变影响微管组装和结构

研究人员首先通过微管整合实验发现，与野生型TUBB-V5能有效整合入微管网不同，TUBB-V5 G308S在约70%的转染细胞中呈现弥漫分布，表明该突变损害了αβ微管蛋白二聚体形成或整合入微管的能力。

在基因编辑的TUBB^G308S细胞中，研究人员观察到微管密度降低、核化事件减少、EB1-GFP彗星数量下降，以及微管弯曲度增加。这些结果表明G308S突变影响了微管的稳定性、动力学和结构完整性。

TUBB G308S变体导致原发性纤毛缺陷

在患者成纤维细胞和TUBB^G308S细胞模型中，血清饥饿诱导的纤毛形成频率均显著降低。体内实验进一步证实，携带TUBB5 G308S突变（小鼠TUBB同源基因）的嵌合小鼠在小脑颗粒细胞层和肾脏中均表现出纤毛减少，并出现肾小球囊肿和肾小管囊肿等典型纤毛病病理特征。

TUBB G308S变体损害原发性纤毛形成和中心体迁移

机制研究表明，G308S突变影响纤毛发生的早期阶段。在血清饥饿后4-6小时，突变细胞的纤毛形成已显著延迟。进一步实验发现，突变细胞中动力蛋白介导的囊泡运输受损，转移素阳性囊泡在胞质中分散而非正常聚集在核周区域。同时，纤毛中心体向质膜的迁移距离缩短，微管推动力不足可能是主要原因。

等位基因特异性效应分析

研究人员还探讨了TUBB突变影响纤毛发生的机制特异性。发现单倍体不足（haploinsufficiency）不是主要原因，因为TUBB单倍体细胞的纤毛形成正常。而功能获得性（gain-of-function）机制得到证实，因为G308S、E401K和E108K三个错义突变在过表达实验中均损害纤毛发生，且损害程度与患者临床表型严重性相关。

研究结论与讨论部分指出，这项工作首次建立了微管蛋白突变与神经发育纤毛病之间的直接联系，提出了缺陷纤毛发生作为部分微管蛋白病患者致病因素的新机制。三个显性TUBB突变（G308S、E108K和E401K）均影响纤毛发生，且患者MRI表现出不同程度的纤毛病样脑部特征。

值得注意的是，不同TUBB突变可能通过不同分子机制影响纤毛发生。G308S可能通过破坏微管稳定性影响纤毛发生早期阶段；E401K主要影响微管蛋白折叠途径；而E108K则表现为中间表型。这种机制异质性解释了为何只有部分TUBB突变会导致纤毛病样表型。

该研究的临床意义在于为同时表现微管蛋白病和纤毛病特征的患者提供了遗传诊断新视角，将TUBB列为候选纤毛病基因。此外，由于原发性纤毛在成年大脑神经元中仍存在并发挥功能，针对纤毛的干预措施可能为传统认为“不可治疗”的发育性微管蛋白病提供新的治疗时间窗口。

未来研究方向包括探索其他微管蛋白基因（如TUBA1A、TUBB2A、TUBB2B、TUBB3、TUBG1）在纤毛发生中的作用，以及在不同遗传背景下系统评估TUBB突变对大脑发育的影响。这些研究将进一步完善我们对微管-纤毛轴在神经发育疾病中作用的理解。