SPACEc：用于多重成像分析的流线型交互式Python工作流程及其在组织空间生物学中的应用

《Nature Communications》：SPACEc: a streamlined, interactive Python workflow for multiplexed image processing and analysis

本研究针对多重成像数据分析工具碎片化、效率低、跨学科应用难的问题，开发了SPACEc这一基于Python的可扩展平台。该平台将图像处理、细胞分割、数据预处理集成到单一工作流程中，并通过并行化和GPU加速提升计算性能，同时引入斑块邻近分析等创新方法更精确映射局部细胞邻域和相互作用。SPACEc还通过直观界面简化了深度学习注释等高级方法，使不同背景的研究人员能够更深入地了解组织结构和细胞微环境。

　　

在当今生物医学研究领域，多重成像技术彻底改变了我们研究组织组织的能力，通过在原生环境中捕获数千个细胞和分子，为科学家提供了前所未有的组织微环境观察窗口。然而，这些数据集通常每个图像就包含数十GB的数据量，需要复杂的工作流程，限制了它们的广泛应用。当前工具往往碎片化、效率低下，难以跨学科采用，研究人员不得不在多种工具和编程语言之间切换，这大大增加了分析难度和时间成本。

为了应对这些挑战，斯坦福大学Garry P. Nolan团队开发了SPACEc（Structured Spatial Analysis for Codex Exploration）框架，这是一个基于Python的可扩展平台，旨在从始至终简化空间成像分析。该平台将图像处理、细胞分割和数据预处理集成到单一工作流程中，同时通过并行化和GPU加速提高计算性能。

SPACEc引入了创新方法，包括斑块邻近分析（patch proximity analysis），以更精确地映射局部细胞邻域和相互作用。该平台还简化了深度学习方法注释等高级方法，通过直观的界面使其更易于使用。通过结合效率、准确性和可用性，该平台使不同背景的研究人员能够更深入地了解组织结构和细胞微环境。

关键技术方法

研究团队利用来自健康者和扁桃体炎患者的扁桃体组织样本，通过CODEX Phenocycler技术生成多重成像数据。主要技术方法包括：使用Mesmer和Cellpose算法进行细胞分割；采用Z归一化等多种标准化方法处理数据；通过Leiden聚类和机器学习方法（支持向量机SVM和STELLAR）进行细胞类型注释；开发了斑块邻近分析、细胞邻域分析、空间背景图谱和细胞-细胞相互作用分析等创新空间分析方法；利用TissUUmaps进行交互式可视化。

SPACEc框架

SPACEc开创了一个创新性分析框架，不仅加速和整合了分析流程，还引入了先进的空间分析方法。研究团队开发了创新的高通量斑块邻近分析（patch proximity analysis），用于分析感兴趣结构（如肿瘤边缘、血管系统和免疫生态位）周围的细胞微环境。这种方法将焦点从检查单个组织单元的组成转移到探索从这些单元向外辐射的环境差异。

与之前仅关注单区域或空间图中局部积累的斑块分析不同，SPACEc通过空间、噪声敏感的聚类检测数据集中所有区域的斑块，实现跨区域和条件下单个斑块及其周围生态位的精确识别。该分析经过CPU并行化处理，可在高复杂性数据集上以高通量执行。

应用实例展示

为展示SPACEc的实用性，研究团队处理了来自健康和炎症扁桃体的CODEX Phenocycler数据集。首先，流程从组织微阵列（TMA）中提取并标记单个扁桃体组织，使用Mesmer分割数据，对结果分割掩模进行可视化，过滤和Z归一化数据，然后存储在annotata格式中。

细胞类型通过Leiden聚类和细胞类型特异性标记进行注释。交互式聚类可进一步协助优化聚类，无需额外编码。细胞类型标签随后映射回其原始空间坐标，以根据已知生物学验证细胞类型标签的准确性。

为展示SPACEc的分析能力，研究团队执行了流程中集成的先进空间分析。识别并注释了六个细胞邻域（CNs），发现炎症扁桃体比健康扁桃体有更多成熟的生发中心，这与抗原特异性B细胞初始激活后B细胞的定植和增殖一致。

通过计算每个组织的空间背景图谱，研究团队选择了三个CNs（边缘区、生发中心和富含B细胞和树突状细胞的边缘区）之间的界面作为示例，展示重心坐标图的实用性。在重心坐标图中，观察到生发中心CN和富含细胞的边缘区CN之间的界面在炎症扁桃体中特别明显，表明参与免疫细胞启动和激活的CNs有更强的交叉。

除了描述内在组织结构外，SPACEc还可用于检查细胞-细胞和CN-CN相互作用。例如，可以计算围绕定义组织结构（如生发中心CN）的细胞组成。研究团队投射了从边界细胞辐射距离15至25μm的同心圆，观察到在炎症扁桃体中，生发中心CN周围CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞的富集。

同样，斑块邻近分析可扩展至分析每个CN边界的CNs组成。最后，研究团队观察了两种条件之间细胞-细胞相互作用的变化，发现与健康扁桃体相比，炎症扁桃体中生发中心B细胞（GCB）更靠近树突状细胞，表明在扁桃体炎期间抗原呈递增加和B细胞成熟增强。

性能基准测试

研究团队将SPACEc与其他开源软件包在运行时间、机器学习细胞类型转移的准确性和峰值内存使用方面进行了基准测试。结果显示，SPACEc在空间图像分析方面设立了新标准，结合了广泛的功能和卓越的计算效率和准确性。它不仅在所有比较工具中提供了最全面的功能套件，而且显著优于现有方法，运行时间最高快31倍。

工程创新，如细胞-细胞相互作用计算的四倍加速，使SPACEc独特适合大规模空间研究。其灵活的基于机器学习的细胞类型注释在所有基准测试数据集中实现了最高的F1分数，显示其稳健性和适应性。SPACEc还在大多数下游分析中展示了1.3-20.8倍的较低峰值内存使用。

重要的是，SPACEc在Mac OS和高端Linux平台上均提供一致的高性能结果，使在消费级硬件上无缝使用并轻松扩展至复杂的大数据集成为可能。这些进步使SPACEc成为能够显著加速空间生物学发现的变革性工具。

研究意义与展望

SPACEc提供了一个基于Python的全面结构化工作流程，用于分析多重图像。该流程执行组织提取、细胞分割和可视化、数据预处理和归一化以及细胞类型注释的基本步骤。此外，它支持交互式数据检查和各种格式输出的空间分析。

SPACEc结合了一系列分析工具，确保彻底和多功能的分析过程，同时允许扩展新分析的灵活性。通过详细的逐步说明，各级用户均可实施该工作流程，有效导航空间景观并从高度多重图像中提取有价值的生物学见解。该平台的模块化设计支持与新兴工具（如基于深度学习的细胞分类工具CellSighter、统一分割和注释工具CellGate以及自动染色预测工具Nimbus）的未来集成，使用户能够根据不断发展的分析需求定制流程。

这项研究通过开发高效、准确且用户友好的分析平台，解决了多重成像数据分析中的关键瓶颈问题，为更广泛的研究社区提供了强大的工具，有望推动组织生物学和疾病机制研究的进一步发展。