利用多酶等温快速扩增技术对壁虎（Gekko gecko）进行分子鉴定

《Analytica Chimica Acta》：Molecular Authentication of Gekko gecko Using Multienzyme Isothermal Rapid Amplification Technology

基于线粒体细胞色素氧化酶I基因设计的MIRA-qPCR和MIRA-LFD双检测体系，实现了20分钟内快速鉴别中国药典Gecko gecko药材，灵敏度分别达10 pg/μL和1 pg/μL，特异性验证显示无交叉反应。

　　

柴金军|张雅婷|谢玉欣|徐子强|刘昂|杨毅|高立军|夏伟

吉林北华大学医学技术学院，132013，中国

摘要：

目的

本研究旨在建立两种方法，即多酶等温快速扩增结合定量聚合酶链反应（MIRA-qPCR）和MIRA结合侧向流动试纸条（MIRA-LFD），用于快速鉴定中药材Gekko gecko（G. gecko）。

方法

基于G. gecko的细胞色素氧化酶I（COI）序列，设计了MIRA-qPCR的引物和外探针，以及MIRA-LFD的引物和无探针。建立了MIRA-qPCR和MIRA-LFD反应体系并进行了优化，并评估了其性能。

结果

两种MIRA方法均在20分钟内完成了扩增。在MIRA-qPCR方法中，扩增的荧光信号在第八个循环（4分钟）时出现。然而，MIRA-LFD的最佳反应条件为39°C持续8分钟，视觉检测结果在5分钟时出现。为这两种方法设计的引物和探针显示出高特异性，且没有与其他假冒产品发生交叉反应。MIRA-qPCR和MIRA-LFD的灵敏度分别为10和1 pg/μL，表明具有高灵敏度。从商业可用样品中获得的结果在两种方法间一致。

结论

所建立的两种检测方法MIRA-qPCR和MIRA-LFD简单、快速且准确，显示出在鉴定G. gecko方面的巨大潜力。它们可以进一步支持其他濒危或易混淆的中药材的鉴定系统的发展，确保药材来源的准确性和疗效的可靠性。

引言

中药材Gekko gecko是G. gecko Linnaeus的干燥体，以其补肺肾、调节呼吸、缓解哮喘、恢复活力和增强元气的作用而闻名。它常用于治疗肺肾亏虚、哮喘和咯血[1]。此外，还用于治疗抑郁症、保护肝脏和增强免疫力[2]、[3]、[4]。然而，由于过度捕猎和栖息地破坏，G. gecko的野生种群数量急剧下降。目前中国国内市场主要依赖从东南亚进口和人工繁殖来满足需求[5]。这种不断增长的需求导致了市场上出现大量假冒产品，已鉴定出多达17种类型[6]。最常见的替代品包括Gekko swinhonis和Plestiodon chinensis，它们在外观上与G. gecko相似，但在药理作用上有所不同。这些假冒产品侵入中药市场，对公共安全构成严重威胁。因此，迫切需要一种有效、快速和准确的G. gecko产品鉴定方法。

G. gecko的真实性验证不仅包括传统的形态学鉴定[7]，还包括显微镜检查、物理化学分析和蛋白质电泳等[8]。然而，随着中药材掺假方法的多样化，这些传统方法存在显著局限性。分子生物学技术为中药材的鉴定引入了新的方法，并且这些方法正在不断开发和应用。尽管聚合酶链反应具有高特异性和灵敏度，但它相对复杂且耗时，难以用于现场检测。近年来，等温扩增技术以其操作简单、效率高等优点，在分子诊断和中药鉴定中显示出取代聚合酶链反应（PCR）和其他传统技术的巨大潜力。多酶等温快速扩增（MIRA）是一种基于重组酶聚合酶扩增技术的新型等温核酸扩增技术[9]。其核心原理是重组酶和引物形成蛋白质/单链DNA（Rec/ssDNA）复合物。在辅因子和单链结合蛋白的帮助下，该复合物侵入双链DNA，通过链置换DNA聚合酶启动合成。这一过程在恒定温度（约37°C–42°C）下进行，使特定核酸片段在20–30分钟内呈指数级扩增[10]。扩增产物可以通过多种方法检测，包括琼脂糖凝胶电泳、基于探针的荧光实时系统和侧向流动条分析[11]。近年来，MIRA已广泛用于检测病毒（如诺如病毒GII [12]、乙型肝炎病毒 [13] 和猫细小病毒 [14]）、细菌（如耐万古霉素的粪肠球菌 [15]、蜡样芽孢杆菌 [16] 和海链球菌 [17]）、肺炎支原体 [18]，以及动物源性成分（如肉制品 [19]、日本鳗鱼 [20]），为其在中药材鉴定中的潜在应用奠定了坚实基础。

基于G. gecko线粒体细胞色素氧化酶I基因的保守序列，本研究建立了两种检测方法：MIRA结合定量PCR（MIRA-qPCR）（使用FAM/BHQ标记的特异性引物-探针组合进行实时荧光监测）和MIRA结合侧向流动试纸条（MIRA-LFD）（使用生物素/荧光团标记的引物-探针组合，通过侧向流动色谱条可视化）。这些方法为G. gecko药材及其制剂的分子鉴定提供了高效和精确的双重技术保障，对中药的鉴定、市场标准化和物种资源保护具有重要意义。

材料

材料

G. gecko的标准参考物质（中国食品药品监督管理局，批号121587-201802）；无蹼Gekko swinhonis的标准参考物质（中国食品药品监督管理局，批号121734-201601）；Plestiodon chinensis参考草药材料（四川伟科奇生物技术有限公司，批号YCWP24111312）；市售G. gecko样品：编号S-1至S-10。

试剂

DNA等温快速扩增试剂盒（荧光型；WLN8202KIT），DNA

MIRA-qPCR引物和探针的筛选

使用G. gecko DNA作为模板，筛选了九种MIRA-qPCR方法的引物-探针组合（图2A）。F1R1、F1R3和F3R1引物-探针组合表现出良好的扩增效率。然而，这三对引物的阴性对照测试结果（图2B）显示F3R1组合产生了假阳性扩增，而F1R1在扩增曲线末端显示出拖尾效应，可能影响后续实验。

讨论

G. gecko，又称仙蟾、大壁虎或配对蟾，因其重要的药用价值而闻名，是多种中药的关键成分。然而，市场上广泛存在的假冒和掺假G. gecko产品严重威胁了临床应用的安全性。目前，G. gecko的分子鉴定主要方法包括DNA条形码技术和传统的基于PCR的方法[22]、[23]、[24]。然而，

CRediT作者贡献声明

夏伟：监督。刘昂：验证、方法学。徐子强：软件、方法学。高立军：撰写 – 审稿与编辑。杨毅：验证、软件。柴金军：撰写 – 原稿、可视化、软件、方法学、正式分析。谢玉欣：软件、方法学、数据管理。张雅婷：可视化、方法学、调查

资助

本研究未获得公共部门、商业部门或非营利组织的任何特定资助

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

感谢北华大学医学技术学院提供的实验室和实验设备；感谢指导教师高立军；感谢参与本研究的合作者。