胶质细胞上的差异性阿片受体表达及生化耦合特征

《Biochemical Pharmacology》：Differential opioid receptor expression and biochemical coupling profiles on glia

胶质细胞中阿片受体表达及功能研究，检测到MOP、NOP受体在星形胶质细胞、少突胶质细胞样细胞中表达，小胶质细胞经处理后才表达，激活受体引起ERK1/2磷酸化及迁移变化，揭示胶质细胞在中枢免疫调节和疼痛处理中的作用。

　　

萨利姆·F·卡迪姆（Salim F. Kadhim）|约翰·麦克唐纳（John McDonald）|马克·F·伯德（Mark F. Bird）|雷莫·格雷里尼（Remo Guerrini）|吉罗拉莫·卡洛（Girolamo Calo）|大卫·G·兰伯特（David G. Lambert）

莱斯特大学心血管科学、麻醉学、重症监护与疼痛管理系，霍奇金大楼（Hodgkin Building），莱斯特 LE1 9HN，英国

摘要

阿片受体家族包括经典的MOP（μ/μ）、KOP（κ/κ）和DOP（δ/δ）受体，以及非经典的Nociceptin/Orphanin FQ（N/OFQ）肽受体（NOP）。关于这些受体在胶质细胞中的表达存在争议，因为胶质细胞和阿片类物质在疼痛处理和免疫调节中都起着作用。本文详细探讨了这些受体在多种已建立和原代胶质细胞中的表达和功能，包括1321 N1人星形胶质瘤细胞、C6大鼠星形胶质瘤细胞、小鼠原代星形胶质细胞、人MO3.13少突胶质细胞样细胞、人HOG少突胶质瘤细胞、小鼠EOC-20小胶质细胞和小鼠原代小胶质细胞。我们使用了(i) PCR检测mRNA表达，(ii) 放射配体结合实验，(iii) 荧光探针结合实验来研究受体表达情况，(iv) MAPK检测受体激活情况，以及(v) 刮擦实验来研究细胞迁移能力。仅在C6大鼠星形胶质细胞和小鼠原代星形胶质细胞中检测到MOP mRNA；NOP mRNA在1321 N1细胞、C6大鼠星形胶质细胞、小鼠原代星形胶质细胞、MO3.13细胞和HOG细胞中均有表达。DOP和KOP的表达水平存在差异，但未进一步研究。令人惊讶的是，除非用星形胶质细胞培养基处理，否则小胶质细胞（EOC-20或小鼠原代小胶质细胞）不表达阿片受体mRNA。mRNA表达谱与[3H]-DPN与经典阿片受体的结合以及[3H]-N/OFQ与非经典阿片受体的结合结果一致。此外，C6大鼠星形胶质细胞、小鼠原代星形胶质细胞、1321 N1人星形胶质细胞、MO3.13细胞和HOG细胞均能与荧光探针N/OFQ_ATTO594结合；C6大鼠星形胶质细胞和小鼠原代星形胶质细胞还能与MOP荧光探针Dermorphin_ATTO488结合。在同时表达MOP和NOP的细胞中，观察到Endomorphin-1和N/OFQ能够诱导ERK1/2磷酸化，并抑制细胞迁移。研究表明，胶质细胞调节的阿片受体表达可能影响中枢神经系统的阿片免疫调节和疼痛处理机制，需要进一步研究。

引言

阿片类物质通过与阿片受体的相互作用成为临床治疗中度至重度疼痛的金标准药物。阿片受体分为经典型（MOP、KOP、DOP）和非经典型（N/OFQ，即NOP）[1]。虽然MOP是临床使用阿片类药物的主要靶点，但其使用受到副作用（如痛觉过敏、呼吸抑制、恶心和呕吐）的限制[1][2][3]。此外，阿片类药物的使用还与耐受性和免疫调节有关[4][5][6]。阿片类药物调节免疫系统的机制尚存在争议，提出的机制包括下丘脑-垂体-肾上腺轴、交感神经系统、循环免疫细胞和胶质细胞的作用[4,6]。慢性疼痛，尤其是神经性疼痛，对阿片类药物的反应相对较弱[7]。

胶质细胞包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞，以及最近被归类为胶质细胞的多形胶质细胞[8][9]。不过，胶质细胞也可简单地分为小胶质细胞、室管膜细胞和巨胶质细胞（即星形胶质细胞、少突胶质细胞和多形胶质细胞[10]。星形胶质细胞的数量超过神经元，且在病理状态下会变得活跃，形成星形胶质增生[11]。少突胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的髓鞘生成细胞[12]。小胶质细胞是CNS中的常驻巨噬细胞，在静息状态下具有监视功能；激活后它们会发生形态、分子和功能变化，完全激活的小胶质细胞类似于巨噬细胞[13][14][15]。

胶质细胞在慢性疼痛中起重要作用，并参与中枢免疫调节[4][5][6][16]。本研究全面评估了不同物种多种胶质细胞和细胞系中的阿片受体（经典型和非经典型）表达情况，包括1321 N1人星形胶质瘤细胞[17]、C6大鼠星形胶质瘤细胞[18]、小鼠原代星形胶质细胞、人MO3.13细胞（少突胶质细胞与横纹肌肉瘤的融合细胞）[19]、人HOG少突胶质瘤细胞[20]、小鼠EOC-20小胶质细胞和小鼠原代小胶质细胞。我们使用聚合酶链反应（PCR）检测阿片受体mRNA表达；在mRNA存在的情况下，通过放射配体结合实验和新型NOP及MOP荧光探针N/OFQ_ATTO594[22]、Dermorphin_ATTO488[23]检测细胞表面受体表达。为了研究受体激活情况，我们检测了ERK1/2和p38-MAPK的磷酸化水平[24]，并使用刮擦实验评估细胞迁移能力[25]。

实验方法

组织培养

1321 N1细胞（莱斯特大学/生理学与药理学系）、C6细胞（莱斯特大学/生理学与药理学系）、MO3.13细胞（CELLutions BIOSYSTEMS INC./加拿大）和HOG细胞（由马德里自治大学何塞·安东尼奥·洛佩兹·格雷里尼教授提供），以及小鼠原代星形胶质细胞和小鼠原代小胶质细胞，均使用含有胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Corning，英国）进行培养

mRNA分析

检测了编码经典阿片受体（MOP、DOP、KOP）和非经典阿片受体（NOP）及其前体N/OFQ（ppNoc）的mRNA表达。如表1所示，仅在星形胶质细胞（C6和小鼠原代星形胶质细胞）中检测到MOP mRNA；DOP mRNA在星形胶质细胞（C6和小鼠原代星形胶质细胞）及少突胶质细胞（MO3.13和HOG）中表达；1321 N1细胞中的表达水平较低，△C_t值为20.1。

作者贡献声明

萨利姆·F·卡迪姆（Salim F. Kadhim）：负责撰写、审稿和编辑，原始稿撰写，方法学设计，实验实施，数据分析及结果分析。约翰·麦克唐纳（John McDonald）：负责撰写、审稿和编辑，原始稿撰写，方法学设计，实验实施，数据分析。马克·F·伯德（Mark F. Bird）：负责撰写、审稿和编辑，资源准备，概念构思。雷莫·格雷里尼（Remo Guerrini）：负责撰写、审稿和编辑，原始稿撰写，资源协调，概念构思。吉罗拉莫·卡洛（Girolamo Calo）：负责撰写、审稿和编辑，原始稿撰写，指导工作，资源协调，概念构思。大卫·G·兰伯特（David G. Lambert）：参与部分工作。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢莱斯特大学先进成像设施（RRID: SCR_020967）的支持，特别是K Straatman博士的帮助。同时感谢Davide Malfacini博士在图形摘要制作方面的协助。