Wilms瘤1相关蛋白通过KLF2-IQGAP3途径调节内皮细胞中的应力纤维储备

《Cellular Signalling》：Wilms' tumor 1-associating protein regulates the stress fiber reservoirs in endothelial cells via KLF2-IQGAP3

应力纤维通过调控基因表达影响内皮细胞形态及血管疾病发生发展，WTAP蛋白通过调控IQGAP3基因表达介导应力纤维形成，PKC/NF-κB通路参与WTAP的上调，KLF2通过调控IQGAP3表达影响应力纤维分布。

　　

吴胜云|朱玉婷|程可茹|严晓|王楠平|张鹏|王银芳

上海中医药大学附属普陀医院中央实验室，中国上海

摘要

应力纤维以其收缩特性而闻名，它们在细胞之间或细胞与基底之间起到黏合剂的作用，在细胞形态发生中起着关键作用。应力纤维的异常与多种病理状况的发病和进展有关。Wilms肿瘤1-关联蛋白（WTAP）是N6-甲基腺苷（m6A）甲基转移酶复合体的核心成分，积极参与m6A修饰，从而调节基因表达。我们研究了WTAP对应力纤维的影响及其潜在机制。研究表明，佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）能迅速诱导内皮细胞（ECs）中WTAP的上调，这种效应在抑制PKC、Ca²⁺或NF-κB信号通路后得到缓解。WTAP的敲低促进了应力纤维的形成，并阻碍了PMA诱导的足突体组装。在剪切应力下，WTAP敲低的内皮细胞表现出沿流动方向排列的倾向，这一点通过VE-钙粘蛋白染色得到证实。通过RNA-seq分析，我们发现含有IQ基序的GTP酶激活蛋白3（IQGAP3）是WTAP的关键靶标，对内皮细胞中的应力纤维形成至关重要。荧光素酶报告基因实验揭示了krüppel样因子2（KLF2）在IQGAP3启动子和第一个内含子上的调控作用，从而调节其表达水平。KLF2的敲低部分逆转了WTAP介导的应力纤维形成抑制作用。此外，用PMA处理大鼠胸主动脉会导致内皮细胞中WTAP蛋白水平升高。我们的研究强调了WTAP在调节内皮细胞中应力纤维池方面的关键作用，这对血管疾病的发病机制具有重要意义。

引言

细胞应力纤维是细胞内的重要机械结构，它们维持细胞形态和稳定性，同时也深刻影响各种细胞生理活动。应力纤维通过整合素等分子与细胞外基质紧密连接，将机械信号从细胞内部传递到外部环境，从而调节细胞与环境的相互作用。在细胞迁移、形态变化和极化过程中，应力纤维会动态调整其分布和强度以适应细胞环境的变化[1,2]。这种适应性调节对于保持细胞形态和保障正常细胞功能至关重要。此外，应力纤维还具有识别和传递机械信号的能力，影响基因表达模式和蛋白质合成速率。

最近的研究揭示了内皮应力纤维异常与心血管疾病的发生和发展之间存在密切联系。内皮细胞（ECs）不断受到血管腔内血流产生的剪切应力作用，其基因表达和表型会随之发生改变[3]。层流剪切应力通常会促进ECs的抗炎、抗增殖和抗动脉粥样硬化反应，而振荡剪切应力则可能引发ECs的增殖、炎症和动脉粥样硬化[4,5]。值得注意的是，应力纤维会针对这些剪切应力的变化动态重新排列和调整张力。因此，深入研究细胞应力纤维的功能和调控机制对于阐明心血管疾病的分子机制至关重要。

细胞应力纤维的形成和稳定受到复杂信号通路的调控。外部机械刺激，如流体剪切应力 and 基底硬度的变化，会激活RhoA/ROCK信号级联反应，进而触发LIM激酶/Cofilin，促进应力纤维的组装[6]。同时，焦点粘附激酶（FAK）、paxillin、Rac1、Cdc42（细胞分裂周期42）和核转录因子在调节应力纤维中也起着关键作用[1,7]。含有IQ基序的GTP酶激活蛋白（IQGAP）基因家族编码了一组高度保守的支架蛋白，主要包括IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3亚型。最新研究揭示了它们在细胞骨架动态中的作用。例如，IQGAP1与肌动蛋白结合蛋白（如filamin和caldesmon）以及细胞骨架蛋白（如微管蛋白和中间丝）相互作用，以稳定细胞骨架。此外，IQGAP1还与Rac1/Cdc42相互作用，从而影响细胞结构[8,9]。IQGAP2通过影响多个信号通路（包括Rac1/Cdc42、钙信号通路和Wnt/β-连环蛋白信号通路）来调节细胞结构[10,11]。另一方面，IQGAP3特异性地与活性的、GTP结合形式的Ras相互作用，调节细胞增殖[12]，或与多种细胞骨架蛋白结合，从而调节它们的组装、稳定性和动态。了解IQGAP基因的调控机制将有助于我们理解细胞骨架的重排。

Wilms肿瘤1-关联蛋白（WTAP）在RNA的N6-甲基腺苷（m6A）甲基化过程中起着重要作用，这是一种关键的表观遗传调控机制。WTAP的异常表达模式与多种疾病的发病和进展密切相关[13]。最近的研究表明，WTAP可能调节甲基转移酶3（METTL3）的蛋白质稳定性，从而影响棕色脂肪组织的发育和能量代谢[14]，这一过程与心血管疾病的风险因素密切相关。此外，WTAP在炎症刺激下上调，并通过调节巨噬细胞中相关基因的m6A修饰水平来促进促炎反应[15]。本研究探讨了WTAP是否能够调节IQGAP3的表达，进而影响内皮细胞中的应力纤维形成。

实验部分

细胞培养和试剂

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自ScienCell公司（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德），并在含有生长补充剂（ScienCell）、5%胎牛血清（FBS，ScienCell）、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的EC培养基中培养，培养条件为5% CO₂、37°C。所有实验均使用传代3-5代的HUVECs。HEK-293T细胞来自美国类型培养收集中心，培养在添加了10% FBS的Dulbecco改良Eagle培养基中。

钙/PKC-NF-κB信号通路调节内皮细胞中的WTAP表达

PKC是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在多种信号转导通路和细胞功能中发挥重要作用，它们的激活会显著导致内皮功能障碍。我们评估了暴露于PMA（一种特定的PKC激活剂，也会激活NF-κB）的内皮细胞中WTAP的表达水平。观察到PMA处理可以迅速诱导ECs中主要的两种PKC亚型PKCδ和PKCη的磷酸化。

讨论

在患有败血症、银屑病、类风湿性关节炎和克罗恩病的患者中观察到WTAP表达升高[15,19,20]。最近的研究表明，C/EBP-β和NF-κB信号通路通过转录激活共同调节WTAP的表达。在THP-1细胞和人类巨噬细胞中，LPS可以诱导WTAP表达；而在微血管内皮细胞中，TNFα是诱导因子[15]。

CRediT作者贡献声明

吴胜云：研究工作。 朱玉婷：研究工作。 程可茹：研究工作。 严晓：资源提供、研究协助。 王楠平：监督、概念设计、写作 - 审稿与编辑。 张鹏：数据分析、资金获取、研究工作、写作 - 审稿与编辑、监督、初稿撰写。 王银芳：数据分析、资金获取、数据管理、研究工作、写作 - 审稿与编辑、初稿撰写、项目管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（82170479、82171552）和上海市自然科学基金（21ZR1457500）以及上海市普陀区科学技术局（ptkwws202102）的支持。