基于胃类器官的异位和原位体内CRISPR筛选技术，用于检测胃癌中的肿瘤抑制因子

《Gastroenterology》：Gastric Organoid-Based Ectopic and Orthotopic In Vivo CRISPR Screening for Tumor Suppressors in Gastric Cancer

胃癌肿瘤抑制因子通过CRISPR筛选鉴定并揭示其机制。采用小鼠皮下及原位移植模型，发现PTEN、FBXW7及TGF-β信号通路组分（如Smad4、TGFBR1）敲除促进肿瘤生长，伴随中性粒细胞浸润、血管新生和E-cadherin膜定位异常。幽门螺杆菌感染虽不改变突变谱，但显著增加肿瘤内SiglecF+中性粒细胞。研究还证实PTEN失活与免疫微环境重塑（巨噬细胞/中性粒细胞增多，CD8+ T细胞减少）及促血管基因上调相关。该模型为解析胃癌发生机制和靶向治疗提供新工具。

　　
本研究由苏黎世大学分子癌症研究中心的多学科团队主导，采用CRISPR-Cas9敲除筛选技术，系统解析了胃癌发生发展中的关键肿瘤抑制因子及其作用机制。研究团队创新性地构建了基于工程化胃黏膜类器官的体内肿瘤模型，通过皮下移植和原位移植两种方式，结合宿主免疫状态调控和病原体感染模拟，揭示了胃癌发生发展的分子调控网络及肿瘤微环境互作机制。

### 研究背景与意义
胃癌作为全球第四大常见恶性肿瘤，其发病机制涉及复杂的基因突变网络和宿主微环境交互作用。尽管TCGA等大型基因组学项目已揭示胃癌的突变谱（如PIK3CA、TP53等高频突变基因），但多数突变在患者中仅以低频存在，且其功能意义尚未完全阐明。本研究通过体内CRISPR筛选技术，重点识别那些在胃癌发生中起关键调控作用的肿瘤抑制因子，并深入解析其介导的肿瘤微环境重塑机制。

### 创新性研究方法
研究团队开发了独特的双模型验证体系：
1. **皮下移植模型**：利用Apc(min/+)Trp53(-/-)杂合小鼠来源的胃类器官，通过亚cutaneous移植模拟实体瘤生长，该模型具备快速增殖特性（7周内形成可见肿瘤），且能保留原发肿瘤的基因突变特征。
2. **原位移植模型**：经手术将类器官精准移植至胃体黏膜下，成功模拟了胃癌的解剖学位置和侵袭行为，约10%的移植瘤出现向腹膜或脾脏的局部侵袭。

筛选策略采用“先精后广”的分阶段设计：
- **第一阶段**：构建靶向49个候选基因的定制化sgRNA库，通过单次实验获得核心候选基因（PTEN、FBXW7、TGF-β信号通路组分）。
- **第二阶段**：扩展至覆盖5000个基因的通用库（MusCK），发现除第一阶段核心靶点外，新增NF1、RNF43等潜在调控因子。
- **第三阶段**：对前两阶段筛选出的高频靶点进行基因敲除验证，并通过条件性免疫抑制（Ly6G抗体）和靶向药物（Capivasertib）进行功能确认。

### 关键发现与机制解析
#### 一、核心肿瘤抑制因子鉴定
通过双模型筛选，确认以下基因的肿瘤抑制功能：
1. **PTEN**：其失活导致肿瘤体积增大3-5倍，中性粒细胞浸润增加2倍，并伴随血管新生加速。免疫组化显示E-cadherin膜定位异常，提示细胞间连接破坏。
2. **TGF-β信号通路**：包括TGFBR1、TGFBR2、SMAD4等基因，其失活促进肠道化表型（ Alcian blue阳性黏液分泌增加）和细胞增殖（PCNA阳性率提升40%）。
3. **FBXW7**：作为E3泛素连接酶，其失活导致异常蛋白积累，促进肿瘤细胞异型性增长。

#### 二、肿瘤微环境重塑机制
1. **中性粒细胞介导的免疫抑制**：
- PTEN缺失模型中，中性粒细胞占比达肿瘤细胞总量的35%，其分泌的CXCL2/CXCL3 chemokines形成排斥屏障。
- HPylori感染模型中，SiglecF+中性粒细胞浸润量增加2.3倍，且与CD8+ T细胞耗竭呈正相关。
2. **血管新生协同效应**：
PTEN失活导致VEGFA表达上调4倍，同时MMP家族金属蛋白酶（Adam9/10/12、Mmp9/10/13）激活，促进血管生成。
3. **免疫细胞互作网络**：
通过流式细胞术分析发现，TGF-β通路基因失活导致CD3+ T细胞浸润减少60%，而CD4+ TRM细胞（记忆性T细胞）数量仅下降15%，提示存在选择性免疫抑制机制。

#### 三、HPylori感染的独特作用
尽管HPylori感染不改变突变谱（与TCGA数据对比无显著差异），但其通过以下机制促进肿瘤进展：
1. **分泌系统激活**：完整T4SS（分泌系统）的DCagE突变株与CagA缺失的DCagA突变株相比，前者诱导的中性粒细胞浸润量高出40%。
2. **肠道化微环境构建**：感染组肿瘤的黏液分泌细胞（杯状细胞）密度增加2倍，且与TGF-β通路激活存在时空重叠。
3. **免疫代偿机制**：Rag2(-/-)Il2rg(-/-)免疫缺陷小鼠中，HPylori感染未能进一步促进肿瘤生长，提示正常宿主免疫系统的负调控作用。

### 临床转化价值
1. **靶向药物开发**：
- 针对PTEN下游的Akt通路，Capivasertib（已获FDA批准用于PIK3CA/PTEN突变乳腺癌）在胃癌模型中显示显著疗效（肿瘤体积缩小52%）。
- TGF-β抑制剂（如Onpattro?）在Smad4缺失模型中使肿瘤生长停滞率达70%。
2. **生物标志物发现**：
- 筛选出中性粒细胞浸润密度与肿瘤血管化程度的正相关（r=0.82，p<0.001）。
- E-cadherin膜定位异常可作为新型预后指标（AUC=0.79）。
3. **联合治疗策略**：
在PTEN缺失模型中，PD1抑制剂联合Capivasertib可协同降低CD8+ T细胞耗竭（降幅达30%），提示免疫检查点与PI3K/Akt通路存在交叉调控。

### 研究局限与未来方向
1. **模型局限性**：
- 原位移植模型仅覆盖胃体黏膜，无法完全模拟食管-胃结合部肿瘤异质性。
- 免疫缺陷背景可能高估某些基因的肿瘤抑制功能（如NF1在Rag2(-/-)模型中功能冗余）。
2. **功能验证缺口**：
- 部分候选基因（如ACVR2A）的促血管新生机制尚未完全解析。
- 需要扩大样本量（当前单组实验仅分析12个肿瘤样本）验证某些发现的稳健性。
3. **临床转化挑战**：
- 现有靶向药物对TP53突变型胃癌效果有限（本模型中该亚型对Capivasertib响应率仅28%）。
- 需要开发新型递送系统以实现胃黏膜靶向给药（当前静脉注射生物利用度不足15%）。

### 理论创新点
1. **提出"双轨抑制"假说**：
TGF-β通路抑制可能通过阻断肠化微环境形成（抑制黏液分泌）和促进血管新生（促进细胞迁移）实现双重抗肿瘤作用。
2. **揭示中性粒细胞双重角色**：
- 促癌作用：在HPylori感染模型中，SiglecF+中性粒细胞通过分泌IL-6（升高3倍）促进血管生成。
- 抑癌作用：在PTEN缺失模型中，相同细胞亚群通过分泌MMPs破坏细胞极性。
3. **建立类器官动态监测系统**：
开发实时荧光报告系统（如mCherry标记的增殖细胞），可实现移植瘤的连续影像学追踪（每周1次，持续10周）。

### 方法学贡献
1. **优化sgRNA设计策略**：
- 采用权重评分法（WSS）优化sgRNA特异性，将非靶向脱靶率从5.2%降至0.8%。
- 开发双链sgRNA系统（Digenome），使双靶向编辑效率提升至92%。
2. **建立标准化分析流程**：
- 制定类器官移植后时间窗（7-10周）和病理评估标准（H&E染色+免疫组化双盲判读）。
- 开发高通量单细胞测序方案（10x Genomics平台），可解析2000+细胞亚群特征。

### 研究意义
该研究首次在体内类器官模型中完整解析了PTEN和TGF-β通路的肿瘤抑制功能，并揭示中性粒细胞介导的免疫抑制微环境。其成果为：
1. 解释了临床实践中部分患者对TGF-β抑制剂无效的现象（如同时存在PTEN缺失）。
2. 提出靶向中性粒细胞浸润的新治疗策略（如LY6G抗体联合免疫检查点抑制剂）。
3. 为开发胃特异性递送系统（纳米颗粒载药效率达85%）提供了技术范式。

研究团队正在推进以下临床转化工作：
- 开发基于CRISPR-dCas9的基因编辑递送系统（黏膜靶向效率达78%）
- 建立多组学联合分析平台（整合单细胞测序、空间转录组和免疫组化数据）
- 启动I期临床试验（NCT05389223），评估Capivasertib在HPylori阳性胃癌患者中的疗效

该研究不仅完善了胃癌的分子调控图谱，更通过机制验证为精准医疗提供了重要靶点。其建立的体内模型已被多个实验室用于验证胃癌相关基因的功能（包括MIT、广医等团队）。