Osmanthus fragrans 花期转变过程中 OfFD 及其可变剪接的功能特性研究

《Industrial Crops and Products》：Functional characterization of OfFD and its alternative splicing in floral transition of Osmanthus fragrans

山茶花Osmanthus fragrans ‘Sijigui’中FD基因通过内含子保留产生两种剪接异构体OfFDα和OfFDβ，OfFDβ因提前终止密码子缺失SAP结构域。两者均定位核内，在低温19℃时表达量显著升高，但异构体比例不受温度调控。酵母双杂交显示OfFDα需与FT同源蛋白OfFTa形成复合物激活AP1a启动子，而OfFDβ可直接激活该启动子。双荧光素酶实验验证OfFDβ单独即可显著增强AP1a转录活性。转化Arabidopsis和Osmanthus中过表达两种异构体均提前开花，且上调下游开花基因AP1a和LFY表达。该研究揭示交替剪接在温度响应型开花调控中的新机制，及异构体通过不同互作途径激活开花基因的分子基础。

　　
该研究聚焦于金桂（Osmanthus fragrans）中关键开花调控基因FD的交替剪接机制及其功能分化。研究发现，金桂FD基因通过第一内含子保留产生两种剪接变体（OfFDα和OfFDβ），其表达模式与环境温度及组织类型密切相关，但两者的比例不受温度调控。通过亚细胞定位和酵母双杂交实验证实，OfFDα定位于细胞核，需与FT同源蛋白OfFTa形成复合物激活下游开花基因，而OfFDβ虽同样定位于细胞核但缺乏与FT互作的SAP结构域，可直接激活开花相关基因。这种功能分化揭示了FD基因在开花调控网络中的多重作用机制。

研究首先通过RNA测序和实时荧光定量PCR技术，发现金桂FD基因存在内含子保留型剪接。OfFDβ因第一内含子提前终止密码子导致其产物缺失SAP结构域，而OfFDα完整保留该结构域。通过构建系统发育树证实，金桂FD蛋白与草莓FD同源性较高，进化关系明确。进一步实验显示，在19℃低温环境下，OfFDα和OfFDβ的表达量均显著上调，且在花芽组织中呈现特异性高表达模式，这与其促进开花的功能直接相关。

在功能验证方面，研究采用瞬时表达和稳定转染技术，发现过表达OfFDα和OfFDβ均能加速拟南芥开花进程。定量分析显示，转植株在开花时间上平均提前8天，叶数减少5片，同时激活FT、SOC1、AP1和LFY等核心开花基因的表达。值得注意的是，OfFDβ在缺乏FT蛋白的情况下仍能直接激活AP1基因启动子，而OfFDα必须与FT形成复合物才能发挥转录激活功能。这一发现突破了传统认知中FD蛋白仅通过FAC复合物调控开花的模式，揭示了剪接变体在功能上的独立性和协同性。

通过酵母双杂交和双荧光素酶报告基因系统，研究深入解析了两种异构体的作用机制。实验证实OfFDα与FT蛋白存在直接相互作用，而OfFDβ因SAP结构域缺失无法与FT形成稳定复合物。在双荧光素酶实验中，当同时表达OfFDα和FT时，AP1启动子活性显著增强；而OfFDβ单独即可显著激活该启动子。这种差异化的调控方式暗示了环境温度可能通过影响FT蛋白的稳定性来间接调控OfFDα的功能。

该研究在以下方面取得重要进展：其一，首次揭示金桂FD基因存在内含子保留型剪接，并明确其剪接位点与终止密码子的精确位置；其二，发现SAP结构域不仅是FT互作的必要基序，更是FD蛋白形成复合物调控下游基因的关键；其三，提出环境温度可能通过影响FT蛋白的磷酸化状态或翻译后修饰，间接调控OfFDα与FT的复合效率，从而调节开花进程。这些发现为理解木本植物开花调控的分子机制提供了新视角，特别对揭示低温促进开花的分子开关具有重要参考价值。

在实验设计上，研究采用多组学整合分析策略。通过比较转录组测序和qRT-PCR数据，确认温度梯度实验中基因表达变化的可靠性。在亚细胞定位实验中，创新性地使用D53核定位标记蛋白作为对照，确保观察结果的可信度。酵母双杂交实验采用分阶段验证法，先通过空载体对照排除背景干扰，再通过增量实验明确互作关系。这些方法学上的严谨性有效保证了研究结论的科学性。

值得注意的是，该研究首次在木本植物中发现FD基因剪接变体具有独立调控功能的现象。通过构建模式植物拟南芥的过表达体系，成功将金桂FD的功能特性转移到其他物种中，这为跨物种功能研究提供了新范式。同时，研究提出的"双路径调控模型"（FAC依赖型与FAC非依赖型）突破了传统单一调控模式的局限，为理解开花基因网络提供了更全面的框架。

该研究的理论价值体现在：通过解析剪接变体功能差异，揭示了基因表达调控网络中空间位阻和结构域修饰的重要性。实验发现OfFDβ直接激活AP1启动子的能力，可能源于其独特的DNA结合方式或辅因子招募能力，这为后续结构生物学研究指明了方向。在应用层面，研究成果可指导金桂等连续开花植物的育种优化，例如通过编辑FD基因剪接位点调控花期稳定性，或构建过表达体系实现早花品种选育。

未来研究可沿着以下方向深入：首先，解析SAP结构域缺失对OfFDβ蛋白构象的影响及其对FT互作的影响机制；其次，探究温度如何通过磷酸化修饰或翻译后修饰影响OfFDα与FT的复合；再者，系统比较不同物种FD剪接变体的功能分化，如柑橘中CiFDα/β的干旱响应机制与金桂的低温响应是否存在保守调控元件；最后，结合单细胞测序技术，动态追踪不同组织类型中两种异构体的时空表达规律，构建更精细的调控网络模型。

该研究为揭示木本植物开花调控的分子机制提供了关键证据，其提出的"剪接异构体功能补偿与协同调控"理论，可能适用于多种经济树种的开花调控研究。实验建立的跨物种功能验证体系，为比较基因组学研究中功能基因的异同分析提供了标准化流程，对农业生物技术改良具有重要参考价值。