《International Immunopharmacology》：Preparation and in vitro functional validation of a novel antibody-siRNA-Exatecan conjugate (AREC)
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新型抗体-siRNA-Exatecan共轭物（AREC）通过siRNA增强亲水性并优化药物抗体比率（DAR=1,2），显著降低毒性，同时实现STAT3基因沉默与拓扑异构酶I抑制剂Exatecan的协同抗肿瘤效应，体外实验证实其高效抑制肿瘤细胞。
向宇|泽萌马|冯姬|明久陈|胡里查·白古德
内蒙古大学化学与化学工程学院，中国内蒙古自治区呼和浩特市 010020
摘要
抗体-小干扰RNA（siRNA）偶联物（ARC）是一种基于抗体-药物偶联物（ADC）概念开发的新疗法。它结合了抗体的靶向特异性和小干扰RNA的基因沉默能力，显示出广泛的应用前景。然而，传统ARC在肿瘤治疗领域的发展面临许多挑战，而DNA拓扑异构酶I抑制剂Exatecan由于其强疏水性和显著的毒性，在临床应用中受到限制。在本研究中，我们开发了一种新型的抗体-siRNA-Exatecan偶联物（AREC）。通过引入siRNA，我们计划提高小分子药物的亲水性，并将药物与抗体的比例（DAR）优化为1和2。这种修饰不仅显著减少了高DAR值相关的毒性副作用，还为评估STAT3基因沉默与Exatecan之间的协同抗肿瘤效应提供了基础。体外实验结果表明，AREC能够有效杀死肿瘤细胞，充分证明了其作为肿瘤靶向治疗多功能平台的巨大潜力。
引言
抗体-siRNA偶联物（ARC）是一种新兴的靶向治疗策略，在生物制药领域逐渐受到关注[[1], [2], [3], [4], [5]]。ARC通过将单克隆抗体（mAb）与siRNA共价结合，实现向特定细胞或组织的精确递送。尽管目前尚无ARC获得上市批准，但一些相关产品已进入三期临床试验。其中进展最快的ARC是一种由靶向转铁蛋白受体1（αTfR1）的单克隆抗体和靶向肌肉组织中DMPK基因的siRNA组成的偶联物（αTfR1-siDMPK）[6,7]。ARC的制备过程相对简单，易于表征和质量控制，可以确保产品的均匀性和一致性[8]。这些特性对于后续的临床转化具有重要意义，能够显著提高药物开发的效率和成功率。此外，ARC利用抗体的靶向作用，通过抗体介导的内吞作用将siRNA高效递送到靶细胞，实现精确的基因沉默。
抗体-药物偶联物（ADC）是一种将单克隆抗体与小分子药物通过化学连接剂共价结合的靶向治疗药物[9,10]。其核心机制是利用抗体的靶向性将细胞毒性药物精确递送到肿瘤细胞，从而在减少对正常组织损伤的同时有效杀死肿瘤细胞。目前，全球已有15种ADC药物获得上市批准，广泛用于血液系统肿瘤和实体瘤的治疗。ADC携带的小分子药物主要包括微管抑制剂、DNA损伤剂和拓扑异构酶抑制剂[11]。其中，拓扑异构酶抑制剂的ADC药物与抗体的比例（DAR）通常可以达到8，因为它们的毒性较低[12]。然而，研究表明，较高的DAR值会显著改变抗体的亲水-疏水平衡，导致药物分子聚集倾向增加，从而引发潜在的安全问题[[13], [14], [15]]。这些技术难题给ADC的进一步开发和临床应用带来了重要挑战。
目前，ARC在肿瘤治疗中的应用仍处于探索阶段[2,3]。为了进一步扩大其在肿瘤领域中的应用，我们开发了一种新型的ARC，称为AREC（抗体-RNA-Exatecan偶联物）。AREC由三部分组成：Herceptin（一种靶向HER2的单克隆抗体）、靶向信号转导子和转录激活因子3（STAT3）的siRNA，以及拓扑异构酶I抑制剂Exatecan。Herceptin在乳腺癌的治疗中起着重要作用[[16], [17], [18]]。我们希望利用其靶向性和内吞作用，将药物精确递送到过度表达HER2的肿瘤细胞。STAT3在肿瘤细胞的增殖、存活和免疫逃逸中起关键作用，其异常激活与多种肿瘤的进展密切相关[[19], [20], [21]]。作为拓扑异构酶I抑制剂的Exatecan与Herceptin结合后，在HER2阳性乳腺癌和胃癌等实体瘤中表现出显著的抗肿瘤活性[22]。在本研究中，我们创新地将siSTAT3与Exatecan结合，引入siRNA以提高药物的亲水性并降低DAR值，并探讨两者之间是否存在协同抗肿瘤效应。这种组合设计充分利用了Herceptin的靶向性，确保药物能够精确递送到肿瘤细胞，并通过Exatecan的细胞毒性效应显著增强抗肿瘤效果。此外，siSTAT3的基因沉默效应可能进一步抑制肿瘤细胞的增殖和存活，从而提高整体治疗效果。这种创新的AREC设计为肿瘤治疗提供了新的策略，尤其是在HER2阳性肿瘤的治疗方面，显示出其在靶向治疗领域的广泛应用前景。
章节片段
ARC偶联物的制备
从罗氏公司购买的Herceptin注射液使用50 kDa超滤膜（Amicon Ultra）进行缓冲液交换，用含有5 mM EDTA的PBS溶液替换原缓冲液，并调整pH至6.0。使用Nano Drop分光光度计测量抗体浓度，约为10 mg/mL。随后加入磷酸钾溶液（pH 9.0），将整体溶液的pH调整至约7.4。新鲜制备的10 mM
ARC偶联物的制备
在ARC的研究中，常见的偶联策略包括随机偶联（赖氨酸偶联）、半胱氨酸偶联（通过还原抗体的二硫键）和糖特异性偶联。其中，赖氨酸偶联存在异质性问题，而糖特异性偶联则面临成本较高的挑战。基于此，我们选择了一种高效的半胱氨酸偶联策略，通过还原抗体的二硫键释放自由巯基，以实现siRNA与
讨论
本研究开发了一种新型的抗体-siRNA-Exatecan偶联物（AREC），以实现Exatecan和siSTAT3的靶向共同递送，从而增强对肿瘤细胞的杀伤效果。先前的研究表明，由拓扑异构酶I抑制剂和Herceptin组成的ADC具有显著的抗肿瘤效果，但这些ADC存在药物聚集和脱靶毒性等问题。此外，尽管现有的ARC显示出一定的潜力，但它们在肿瘤治疗中的应用仍
结论
总之，我们开发了一种新型的AREC，用于将Exatecan和siRNA靶向共同递送到肿瘤细胞。这种创新的偶联物利用了抗体的特异性和内吞活性，同时沉默STAT3。我们的体外研究表明，当DAR保持在1到2之间时，AREC表现出STAT3沉默与Exatecan之间的协同效应，有效杀死肿瘤细胞。鉴于这些有希望的结果，AREC作为
CRediT作者贡献声明
向宇：撰写——原始草案、验证、方法学、研究、正式分析。泽萌马：软件、数据管理。冯姬：可视化、资源管理、数据管理。明久陈：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、概念构思。胡里查·白古德：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究部分得到了国家自然科学基金（编号32460239和32160231）的资助。这些资助方未参与研究设计、数据收集、数据分析或与研究相关的任何方面。本研究还得到了Biosion公司的部分支持，该公司在研究设计、数据收集、数据分析和报告撰写方面发挥了一定作用。我们能够完全访问研究中的所有数据，并对最终结果拥有决定权
