《International Journal of Cardiology》：Identification of the non-canonical splice-disrupting variants of
TTN in dilated cardiomyopathy
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该研究通过整合生物信息学预测和minigene功能实验，系统筛选了中国扩张型心肌病（DCM）队列中TTN基因的非经典剪接变体，发现16个剪接破坏性变体，使TTN截断变体总数增加14.5%（16/110），遗传诊断阳性率提升1.6%（17/1041）。核心受体（47%）和供体（25%）区域的变体致病性较高。携带剪接变体的患者心脏移植时间显著延长（p=0.002），但生存时间无差异（p=0.594）。研究揭示了非经典剪接变体在TTN致病中的新机制，为DCM分子诊断和遗传咨询提供新依据。
王琳琳|刘浩|赵曲|陈阳辉|孙阳|李瑞|于婷|陈晨|王道文
华中科技大学同济医学院同济医院内科及遗传诊断中心心脏病科
摘要
背景
Titin基因的截短变异（TTNtvs）是扩张型心肌病（DCM）最常见的遗传原因。然而，非经典剪接变异的致病性仍不清楚。
方法和结果
通过整合生物信息学预测和迷你基因功能检测，我们系统评估了78个TTN基因的非经典剪接变异，并在17名患者中发现了16个剪接破坏性变异。这一发现使TTNtvs的总数增加了14.5%（16/110），同时将中国DCM队列的遗传诊断率提高了1.6%（17/1041）。分布分析显示，这些变异在核心受体区域（47%，8/17）和供体区域（25%，1/4）的阳性率较高。携带剪接变异（经典和非经典）的患者与携带其他截断突变（无义突变和移码突变）的患者相比，后者进行心脏移植的时间显著缩短（37.73 ± 18.96 vs 16.21 ± 15.08；p = 0.002），但两组患者的生存时间没有显著差异（34.36 ± 17.38 vs 39.56 ± 30.41；p = 0.594）。对c.45617-12G>A变异的机制研究表明，该变异通过生成一个新的剪接受体位点，增强了与异质核核糖核蛋白A1的结合，导致部分内含子保留。
结论
通过系统筛查非经典剪接变异，本研究将DCM队列的遗传诊断率提高了1.6%。总体而言，这项研究强调了非经典剪接变异对TTN基因致病性的影响，并进一步完善了DCM的遗传学特征，为开发更全面的遗传检测策略以改进分子诊断和遗传咨询提供了依据。
引言
扩张型心肌病（DCM）是一种异质性心肌病，其特征是心脏腔室扩大和心肌收缩力下降，是心力衰竭的主要风险因素，也是心脏移植的最常见指征[1,2]。其病因多种多样，包括感染、自身免疫、代谢和内分泌因素；然而，相当一部分DCM病例具有遗传基础[3]。大约三分之一的原发性DCM病例具有家族遗传性，而另一半病例病因不明[4]。尽管全外显子测序（WES）被广泛使用，但其诊断率仍然有限（25–30%），导致大多数遗传原因仍未得到明确[5,6]。
Titin（TTN）是与DCM相关的最常见致病基因[7]。该基因包含363个外显子，编码人类已知最大的蛋白质TTN。TTN从Z盘延伸到M线，参与肌节组装和力量缓冲[8]。TTN基因的截短变异（TTNtvs）包括无义突变、移码突变、经典剪接变异和拷贝数变异，占散发性DCM病例的15%和家族性DCM病例的25–30%[9]。
大多数人类基因都经历可变剪接，这是一个高度调控的过程。大约10%的剪接变异与孟德尔疾病相关，并在心脏发育和心血管疾病中起重要作用[10,11]。所有外显子-内含子接头处都存在剪接信号，包括5′端的9个碱基对剪接供体序列和3′端的23个碱基对剪接受体序列[12]。传统上，改变经典剪接位点的变异（如5′端剪接供体GT和3′端剪接受体AG的不变二核苷酸）被归类为致病性或可能致病的变异[13]。然而，越来越多的证据表明，位于不变GT-AG二核苷酸之外的非经典剪接变异同样重要[14]。通过WES鉴定的致病性新生剪接变异中，有高达27%位于非经典区域，通常位于富含保守剪接基序的外显子-内含子接头附近[15]。由于功能验证有限和计算机预测的不确定性，这些变异常被归类为意义不明确的变异（VUSs），从而形成了一个重要的诊断盲区[16],[17],[18]。
为了解决DCM遗传诊断中的这一缺口，我们利用中国DCM队列系统地识别和解读了TTN基因的非经典剪接变异。具体而言，我们使用了我们实验室开发的新型算法SpliceAI与MLCsplice，以增强剪接缺陷的预测能力。MLCsplice采用特定于剪接区域的建模策略，减少了确定偏差，实现了更稳定和更准确的预测性能（评分阈值≥0.5），从而提高了其他可能被忽视的致病变异的检测率[19]。利用这些工具和功能检测，我们旨在识别TTN基因的非经典剪接变异，并探索驱动异常剪接的分子机制。
受试者
共招募了514名健康对照组和1041名来自华中科技大学同济医院的中国DCM患者[20]。根据欧洲心脏病学会的标准[21]，DCM的诊断标准为左心室射血分数<50%或左心室舒张末期直径>预测值的117%，同时排除了显著的冠状动脉疾病和原发性
患者的临床特征
共有1041名患者纳入中国DCM队列。他们的基线临床特征见表1。大多数患者为男性（765/1041；73.5%），发病时平均年龄为52.29 ± 13.65岁。超过一半的患者（722/1041；69.4%）属于纽约心脏协会功能分级III或IV级，平均左心室射血分数为31.48 ± 9.87%。该DCM队列的中位随访时间为44个月。
讨论
通过整合生物信息学预测和功能检测，我们发现了16个TTN基因的非经典剪接破坏性变异，使TTNtvs的谱系增加了14.5%，并将DCM队列的总体遗传诊断率提高了1.6%。此外，位于核心受体和供体区域的变异具有较高的有害性概率。临床研究表明，携带剪接变异的患者进行心脏移植的时间比携带无义或移码突变的患者更晚
结论
通过整合生物信息学分析和体外迷你基因检测，本研究重新评估了中国DCM队列中的78个非经典剪接变异，并识别出16个剪接破坏性变异。我们的工作强调了将功能检测整合到DCM临床遗传工作流程中的价值，填补了变异解读的空白，并为TTN相关心肌病开辟了新的精准医疗途径。
CRediT作者贡献声明
王琳琳：撰写初稿、数据可视化、验证、研究设计、数据分析、数据管理。刘浩：软件开发、方法论设计、概念构思。赵曲：数据验证、数据管理。陈阳辉：撰写、审稿与编辑、方法论设计、数据分析。孙阳：数据可视化、方法论设计。李瑞：研究实施。于婷：研究实施。陈晨：项目监督、项目管理。王道文：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹集、概念构思。
资助
本研究部分得到了国家自然科学基金（编号：82241034、82500583）、上海市科技重大项目（项目编号：2017SHZDZX01）、中国博士后科学基金（项目编号：2025M771975）以及中央高校基本科研业务费（华中科技大学：YCJJ202201016）的支持。
