综述：体外毒理学中外源生物转化系统的利用与特性研究：科学文献的系统性回顾及指导建议

本文系统评估了生物转化系统（BTS）在体外毒理学测试中的应用，发现方法学报告存在显著不足，如BTS来源、浓度、诱导方法等关键参数缺失或描述不明确。通过分析229篇文献，提出BTS标准化报告框架，强调明确BTS类型、物种、蛋白浓度、溶剂系统及对照设置，以提升数据可靠性和可重复性，促进其在化学危害评估中的整合。

　　
在体外毒理学测试中整合生物转化能力（Biotransformation Systems, BTS）是当前毒理学研究的重要挑战，也是推动从动物模型向整合型体外策略过渡的关键。尽管新技术展现出潜力，但规模化受限问题阻碍了高通量应用。短期内，通过添加外源生物转化系统（如S9和微粒体肝分数）与体外测试结合，成为替代动物模型的可行方案。然而，尽管BTS已使用超过50年，其可重复性争议持续存在，引发对其可靠性的质疑：BTS是否本身存在固有缺陷，还是方法学疏漏导致声誉受损？本文通过系统评估科学文献中的BTS应用，提出方法论改进框架。

### 1. 研究背景与核心问题
传统体外模型（如酶促反应或神经元培养）常缺乏天然生物转化能力，导致对前体化合物与代谢产物关系的评估不足。代谢转化可能显著改变化学物的毒性（如活化或解毒），因此需在体外测试中补充BTS。目前主流方法依赖外源BTS（如S9和微粒体），但这些系统存在显著方法学缺陷：
- **来源不透明**：约49.8%的文献未完整描述BTS来源（如物种、是否化学诱导、批次差异等）
- **参数标准化缺失**：仅9.6%研究达到可重复性标准（总分80%以上），关键参数如BTS蛋白浓度常以百分比（v/v）模糊表述
- **控制体系不足**：多数研究仅使用单一对照（如无BTS组），无法有效区分代谢转化与背景噪声

### 2. 研究方法与数据来源
研究采用系统综述方法，通过布尔逻辑检索PubMed、Web of Science等数据库，聚焦BTS在遗传毒性、内分泌干扰等测试中的应用。最终纳入229篇文献，构建包含24个参数域的评估体系（表1），重点考察：
- **BTS特征**（来源、物种、制备方法）
- **反应组件**（蛋白浓度、辅因子、溶剂体系）
- **实验设置**（孵育条件、对照设计）

### 3. 关键发现与问题分析
#### 3.1 方法学报告质量评估（DEERS评分）
通过24项参数的二元评分（有/无），整体评分中位值仅75%。突出问题：
- **BTS特征缺失**（得分率22%-57%）：仅39篇研究完整说明来源物种、批次、动物饲养条件等
- **反应组件不明确**（得分率57%-89%）：尤其蛋白浓度常以百分比表示（如"40% v/v"），缺乏mg/mL标准化
- **实验设置差异大**（得分率87%-95%）：控制组设置不统一，约30%研究未包含BTS相关对照

#### 3.2 元回归分析结果
对BTS蛋白浓度、辅因子浓度与孵育时间等参数的关联性分析显示：
- **无显著相关性**（R2<0.2，p>0.05）：除苯酚代谢（R2=0.6）和环磷酰胺代谢（R2=0.51）外，多数参数间无统计关联
- **时间效应弱**：仅12%研究明确记录孵育时间与温度（建议范围：30-60分钟，37℃/25℃）
- **辅因子体系混乱**：NADPH再生系统使用率不足50%，且仅35%研究详细说明脱氢酶种类与浓度

#### 3.3 质性数据分析揭示模式
- **正向关联**：使用磷酸缓冲体系（87%得分）、非诱导BTS（89%得分）、人类/鱼类来源BTS（92%得分）的研究质量更高
- **负向关联**：外购BTS（得分率68%）、DMSO溶剂体系（得分率72%）、单对照设计（得分率63%）显著降低质量
- **控制组优化**：采用"无BTS组+灭活BTS组"双对照的研究，其终点检测准确率提升40%

### 4. 改进建议与指导框架
#### 4.1 BTS特征标准化
- **来源透明化**：强制要求标注BTS制备方式（内部制备/外部采购）、动物物种（优先人类/鱼类）、化学诱导剂类型（如BNF/PB替代Aroclor）
- **批次控制**：建议供应商提供每批次BTS的CYP酶活性谱（如CYP1A2、UGT活性）
- **制备协议**：需包含动物饲养条件（光照/温度）、肝组织重量占比（建议≥5g/kg）、离心参数（如9000g×20分钟）

#### 4.2 反应组件精确化
- **蛋白浓度单位**：强制使用mg/mL替代百分比，建议范围：0.1-0.5 mg/mL（微型化高通量需求）
- **辅因子体系**：推荐NADPH再生系统（需包含G6P/iso途径脱氢酶浓度），辅因子添加顺序应与代谢途径匹配
- **溶剂控制**：有机溶剂（如DMSO）需稀释至<1%浓度，并说明溶剂对酶活性的影响（参考OECD 150指导原则）

#### 4.3 实验设计优化
- **对照体系**：必须包含"无BTS组"（基础培养基）和"灭活BTS组"（高温灭活+辅因子去除），若涉及细胞系统需增加"无溶剂组"
- **终点检测**：代谢产物分析（LC-MS/MS）与酶活性检测（如CYP450荧光探针）应同步进行
- **参数记录**：需明确记录以下信息：
- BTS蛋白浓度（终浓度及初始浓度）
- 辅因子浓度（NADPH、GSH等）
- 反应体积与孵育条件（温度、pH、震荡频率）
- 控制组设置（建议≥2种对照）

### 5. 实施建议与监管对接
- **供应商责任**：要求商业BTS供应商提供：
- 酶活性证书（CYP、UGT、SULT等关键酶）
- 制备协议（动物来源、诱导剂类型、离心参数）
- 批次间差异评估报告
- **研究设计指南**：
- 优先使用内部制备BTS（得分率提升23%）
- 涉及细胞系统的实验需采用磷酸盐缓冲体系（得分率提升15%）
- 建议将BTS蛋白浓度控制在0.3±0.1 mg/mL（基于细胞毒性研究数据）
- **监管框架**：
- 将BTS特征报告纳入OECD TG 471/473等遗传毒性测试的强制要求
- 建立BTS供应商认证制度（参考FDA的GLP认证体系）
- 开发自动化数据采集模板（包含24参数域的标准化表格）

### 6. 未来发展方向
- **3D细胞模型整合**：当前研究显示，肝细胞球（3D肝类器官）的代谢活性比传统细胞系高40%，但需解决批次差异问题
- **代谢组学辅助**：建议在BTS测试中同步进行代谢组学分析（如LC-MS/MS检测代谢产物谱）
- **PBPK模型优化**：结合BTS参数建立动态模型（如CYP酶浓度与代谢速率的数学关联）

### 7. 结论
研究证实BTS方法学存在系统性缺陷，需建立包含24项核心参数的标准化报告框架。通过强制要求蛋白浓度（mg/mL）、辅因子体系、对照设计等关键信息，可使可重复性提升50%以上。建议监管机构将本框架纳入新修订的OECD/TG 476（微粒体测试）和TG 474（S9测试）指南，推动体外测试的规范化发展。