肾上腺皮质癌转移新机制：非经典Wnt信号通路与细胞骨架重构的关联性研究

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：(Non)canonical Wnt signaling, cytoarchitecture and stemness: new insights from primary nonmetastatic, primary metastatic, regional and distant metastatic models of adrenocortical carcinoma

本研究针对肾上腺皮质癌(ACC)中非经典Wnt信号通路作用机制不明的科学问题，通过建立原发性、区域转移性和远处转移性ACC的2D/3D模型，系统研究了Wnt信号通路与细胞骨架网络的相互作用。研究发现转移性ACC模型呈现向Wnt-Ca2+/Wnt-PCP通路的特异性偏移，伴随β-连环蛋白(β-catenin)、波形蛋白(vimentin)等细胞骨架蛋白的重定位和HOX基因簇的激活，揭示了转移性肿瘤微环境重构的新机制。该成果为ACC靶向治疗提供了重要理论依据。

　　

在肿瘤生物学研究领域，肾上腺皮质癌(Adrenocortical Carcinoma, ACC)作为一种罕见但恶性程度高的内分泌肿瘤，一直面临着治疗手段有限、预后差的临床挑战。早在20年前，科学家们就发现Wnt信号通路在肾上腺皮质肿瘤发生中频繁激活，特别是经典Wnt-β-连环蛋白(β-catenin)通路的激活突变与ACC的侵袭性和不良预后密切相关。然而，科学界对非经典Wnt通路（包括Wnt-PCP和Wnt-Ca²⁺通路）在ACC中的作用却知之甚少，这一知识空白严重限制了对ACC转移机制的全面理解。

肿瘤细胞如何重组细胞骨架网络、协调信号通路并调控细胞命运以启动肿瘤生长和转移，是当前癌症研究的核心问题。非经典Wnt通路以其调控细胞极性和迁移的能力而闻名，但在ACC中的具体功能及其与细胞骨架重构、干细胞特性维持的关联仍属未知领域。正是基于这一科学背景，由Igor Shapiro和Huguette Debaix共同领导的研究团队在《Experimental & Molecular Medicine》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员利用新建立的二维(2D)和三维(3D)培养模型，包括源自原发性肿瘤的NCI-H295R细胞、区域转移的TVBF-7细胞和远处转移的MUC-1细胞，全面比较了与Wnt信号、细胞骨架、上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)和干细胞特性相关的关键分子。这些模型代表了临床上相关的异质性条件，其中NCI-H295R和TVBF-7对应SF-1高表达、高类固醇生成的ACC临床亚型C1A，而MUC-1对应SF-1低表达、低类固醇生成的C1B亚型。

研究团队采用了一系列关键技术方法开展此项工作。通过RNA测序技术分析了ACC细胞系在基础状态和不同刺激条件下的基因表达谱；建立了2D和3D肿瘤球体培养系统，其中3D球体培养使用球形板进行14天培养；利用免疫荧光和免疫组织化学技术对肿瘤球体切片进行蛋白定位分析；基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库进行了临床样本的相关性验证。所有肿瘤样本收集均获得当地伦理委员会批准，并获得了书面知情同意。

基因表达谱分析揭示Wnt通路动态调控

研究人员首先在三种ACC模型中分析了Wnt相关基因的表达模式。结果显示，非转移性原发性肿瘤模型NCI-H295R表现出经典Wnt-β-catenin通路成分的过表达，特别是WNT3A、DVL2和MYC基因表达达到峰值。而转移性模型则呈现向非经典Wnt通路的偏移：TVBF-7偏向Wnt-Ca²⁺通路（WNT5A、LGR5和NFATs高表达），MUC-1则偏向Wnt-PCP通路（WNT5A、VANGL1、ROR1和LGR4高表达）。值得注意的是，基因表达水平表现出两种动态变化：不同模型间代表三种Wnt信号通路的振幅变化，以及每种模型内部因特定刺激而产生的振荡变化。

Wnt信号成分的细胞定位特征

通过β-连环蛋白免疫荧光染色，研究发现NCI-H295R球体呈现典型的经典Wnt通路激活表型，即胞质和强核β-连环蛋白积累。而MUC-1则表现出截然不同的膜性染色模式，且紧密连接的肌动蛋白纤维网络定位于球体周边。TVBF-7则呈现胞质、核和膜定位的混合模式。糖原合成酶激酶3(GSK3)的免疫荧光显示，NCI-H295R球体中有强的斑点状胞质染色，而转移模型则表现出较弱且明显的核积累。

特别值得注意的是，非经典Wnt配体Wnt5A在转移模型中的蛋白水平高于原代培养来源的NCI-H295R，尤其在MUC-1中，Wnt5A蛋白热点常定位于肿瘤球体周边，这些区域还显示出潜在出芽迹象或高度开放染色质特征。在一个晚期转移性原发性ACC的手术切除样本建立的原代培养模型中，研究人员检测到了所有模型中最高的Wnt5A丰度。

EMT和细胞骨架标志物的细胞定位

研究人员观察到NCI-H295R球体持续生长且直径增加，而MUC-1则主动重塑球体生长至高度紧凑的尺寸和形状，常包含体腔样结构。所有三种模型均表达波形蛋白，但MUC-1的模式明显不同：其中间纤维在球体核心逐渐减弱，同时在球体周边增强。上皮-间质转化(EMT)通常被描述为E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白之间的混合状态，称为上皮-间质可塑性，伴随N-钙黏蛋白水平的增加。与此相符，研究人员在两个转移模型中都检测到N-钙黏蛋白表达，其中MUC-1水平最高。

细胞骨架与核纤层（核膜和染色质之间的聚合A型和B型核纤层蛋白网络）物理连接。在这个特定背景下，进一步有趣的标志物包括核纤层蛋白B1(Lamin B1)和核仁素(Nucleolin)，以及基质金属蛋白酶9(MMP9)，因为它经常参与细胞外基质(ECM)成分的降解。与之前的观察一致，研究人员再次检测到MUC-1肿瘤球体周边MMP9热点的增强。TVBF-7和MUC-1都显示出球体周边核仁素染色强度相对较高的趋势，其中MUC-1达到最大侧向水平。还观察到核纤层蛋白B1的差异调节，随着蛋白质从原发性到远处转移来源模型的减弱，明显的核组织丧失。

干细胞标志物的基因表达和细胞定位

细胞可塑性，包括EMT，通过赋予细胞新的表型和功能特征，超出其最初假定的 distinct 细胞状态，从而导致病理状况和恶性肿瘤。这些特征通常已知与干细胞特性相关。适当的标志物，包括c-Myc、Sox9和CD44等，通常与Wnt信号通路下游或相互作用，并且也与HOX基因表达相关。遗憾的是，关于ACC中干细胞标志物的了解甚少。

因此，研究人员接下来调查了模型特异性干细胞模式的存在以及相同条件下相关标志物的调节。他们开始对细胞命运调节的Yamanaka因子（KLF4、Oct4、Nanog、SOX2和C-Myc）以及其他众所周知的干细胞标志物如CD24、CD44、CD68、巢蛋白(Nestin)、ALDH1A1、ALDH1A3、FOXA1和SOX9进行了彻底表征。模型展示了模型特异性的干细胞标志物丰度和表达。此外，重要的标志物在先前显示调节主要ACC簇类型的相同因素下强烈振荡。

HOX基因簇的表达和调控

最后，研究人员分析了HOX转录因子家族，这些属于高度保守的基因簇，决定细胞命运并调节Wnt信号以及干细胞特性。人类Hox基因存在于四个簇中，并包含一个DNA结合同源框区域。HOX转录因子在众多癌症中的失调支持肿瘤发生和癌症进展。

因此，为了理解它们对ACC的贡献，研究人员接下来分析了所有Hox基因。有趣的是，HOXA5/7和HOXB5/7编码区以模型依赖性（SF-1剂量）和药物依赖性（通过调节SF-1剂量）的方式表达和调节。此外，研究人员发现HOXD10基因在TVBF-7和MUC-1中独家表达，其中MUC-1中HOXD9和HOXD11高表达，TVBF-7球体中HOXC10高表达。有趣的是，HOXD10的表达也与TCGA中临床患者样本的Wnt5A表达显著相关，但与Wnt3A无关。

研究结论与意义

这项研究揭示了ACC中Wnt信号通路与细胞骨架重构、干细胞特性之间的复杂相互作用网络。研究结果表明，转移性ACC模型呈现向非经典Wnt信号通路的特异性偏移，这种偏移与细胞骨架蛋白的重构、细胞极性的改变以及HOX基因的特异性激活密切相关。

在临床转化价值方面，该研究首次系统阐明了非经典Wnt通路在ACC转移过程中的核心作用，特别是Wnt5A-HOXD10轴的可能临床意义。研究发现的所有三种ACC模型均表达多种干细胞标志物，这为理解ACC的耐药性和复发机制提供了新视角。此外，研究建立的2D/3D模型系统成功模拟了ACC的异质性和可塑性，为未来药物筛选和个性化治疗策略开发提供了可靠平台。

该研究的创新点在于将非经典Wnt信号、细胞骨架重构和干细胞特性纳入统一的ACC研究框架，突破了传统上仅关注经典Wnt-β-catenin通路的局限。研究结果不仅提供了ACC转移机制的新见解，也为开发针对特定Wnt通路成分的靶向疗法奠定了理论基础，对改善ACC患者预后具有重要的临床意义。