癌相关成纤维细胞H3K18乳酸化通过TNFR2+ Treg细胞招募驱动恶性胸腔积液进展的新机制

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：H3K18 lactylation in cancer-associated fibroblasts drives malignant pleural effusion progression via TNFR2+ Treg recruitment

本研究针对恶性胸腔积液（MPE）中免疫抑制微环境形成机制不清的难题，聚焦TNFR2+ Treg细胞异常聚集这一关键现象，揭示了癌相关成纤维细胞（CAFs）在缺氧微环境下通过糖酵解产生乳酸，诱导组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la），进而上调CXCL16表达，通过CXCL16-CXCR6轴特异性招募TNFR2+ Treg细胞的完整信号通路。该发现不仅阐明了MPE免疫逃逸的新表观遗传调控机制，更为靶向乳酸化修饰打破免疫抑制提供了理论依据。

　　

当肺癌细胞侵袭胸膜腔，恶性胸腔积液（Malignant Pleural Effusion, MPE）便成为晚期肺腺癌患者最致命的并发症之一。由于治疗手段有限，MPE患者中位生存期仅5个月，其快速进展与强烈的免疫抑制微环境密切相关。尽管胸水内存在抗原呈递细胞和效应细胞，宿主免疫系统却始终难以控制肿瘤生长——这背后隐藏着怎样的免疫逃逸机制？

以往研究发现，表达肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）的调节性T细胞（T_reg）是MPE中最具免疫抑制功能的细胞亚群，它们通过高表达免疫抑制分子加速疾病进展。然而，这些"免疫刹车"细胞为何能在MPE中大量聚集，一直是未解之谜。肿瘤微环境中的缺氧状态可能通过某种特殊机制调控了细胞招募过程，而癌相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）作为肿瘤微环境中的"化学信号工厂"，很可能在这一过程中扮演关键角色。

为解答这一科学问题，华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸与危重症医学科的研究团队在《Experimental & Molecular Medicine》上发表了最新研究成果。研究人员通过RNA测序发现，TNFR2⁺ T_reg细胞高表达C-X-C motif趋化因子受体6（CXCR6），而其在MPE中的配体CXCL16水平显著高于其他趋化因子。Transwell实验证实，阻断CXCL16可显著抑制TNFR2⁺ T_reg细胞的迁移能力，揭示了CXCL16-CXCR6轴在细胞招募中的核心作用。

进一步探究CXCL16的来源，流式细胞术分析显示超过90%的CXCL16⁺细胞为CAFs，远高于中性粒细胞（35.29%）、巨噬细胞（50.25%）等其他细胞群体。当研究人员将CAFs与Lewis肺癌细胞（LLC）共注射入小鼠胸腔，MPE体积显著增加，生存期缩短，而CXCL16中和抗体处理可逆转这一效应，证实CAF来源的CXCL16确实促进了MPE进展。

缺氧作为MPE的典型特征，如何调控CAFs中CXCL16的表达？单细胞RNA测序分析显示，CXCL16⁺ CAFs中糖酵解和缺氧信号通路显著富集。体外实验证实，缺氧培养的CAFs随时间推移乳酸产量增加，CXCL16表达同步上升。使用二氯乙酸（DCA）和草氨酸盐（oxamate）抑制糖酵解关键酶后，乳酸和CXCL16水平均下降；而线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮（rotenone）则通过增强糖酵解产生相反效果。

乳酸不仅是代谢废物，更是一种新型表观遗传修饰剂。研究人员发现MPE中乳酸水平升高，CAFs中存在广泛的组蛋白乳酸化修饰，其中H3K18乳酸化（H3K18la）与CXCL16表达呈正相关。临床分析显示，H3K18la高水平患者MPE体积更大、预后更差，且CXCL16水平和TNFR2⁺ T_reg比例更高。

机制层面，CUT&Tag和染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）分析显示H3K18la直接富集在CXCL16基因启动子区。同时，生物信息学预测和实验验证发现转录因子FOXO3可直接结合CXCL16启动子并促进其转录，而FOXO3自身启动子区也存在H3K18la富集。这表明乳酸化修饰通过直接（作用于CXCL16启动子）和间接（通过上调FOXO3）双重机制放大CXCL16表达。

为验证这一通路的功能意义，研究人员构建了LDHA基因敲除的NIH/3T3成纤维细胞系。LDHA敲除细胞乳酸产量减少，H3K18la、FOXO3和CXCL16表达均下降，招募TNFR2⁺ T_reg的能力减弱。小鼠模型中，LDHA敲除成纤维细胞可减轻MPE负荷，延长生存期，而外源性CXCL16可逆转这一保护效应。同样，使用草氨酸盐或β-丙氨酸（lactylation抑制剂）处理也可抑制MPE进展。

关键技术方法

研究纳入2019-2023年间武汉协和医院确诊的肺腺癌MPE患者样本，通过Ficoll密度梯度离心分离胸水单核细胞。采用磁珠分选和流式细胞术分离CAFs及T细胞亚群。利用Transwell实验评估细胞迁移，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子水平，Western blot和Cut&Tag技术分析蛋白表达和组蛋白修饰。通过CRISPR-Cas9技术构建LDHA敲除细胞系，并建立小鼠MPE模型进行体内验证。

研究结果

CXCL16-CXCR6轴介导TNFR2⁺ T_reg细胞在MPE中的招募

RNA测序显示TNFR2⁺ T_reg细胞中CXCR6表达显著升高，且TNFR2信号激活特异性上调CXCR6。MPE中CXCL16水平稳定升高，阻断实验证实其介导了TNFR2⁺ T_reg的特异性招募。

CAFs是MPE中CXCL16的主要来源

流式细胞术证实90%以上CXCL16⁺细胞为CAFs。CAFs培养上清可有效吸引TNFR2⁺ T_reg，且该效应可被CXCL16抗体阻断。小鼠模型中，成纤维细胞共注射促进MPE进展，并依赖CXCL16。

乳酸产生与CAFs中CXCL16高表达相关

单细胞测序显示CXCL16⁺ CAFs富集糖酵解通路。缺氧培养增加CAFs乳酸和CXCL16产量，而糖酵解抑制剂可逆转这一现象。

内源性乳酸通过组蛋白H3K18乳酸化促进CAFs中CXCL16表达

MPE中乳酸水平升高，CAFs存在多种组蛋白乳酸化修饰。葡萄糖处理可剂量依赖性增加H3K18la和CXCL16，而LDHA敲除或β-丙氨酸处理则抑制两者表达。

H3K18la在FOXO3和CXCL16基因启动子区的富集促进CXCL16上调

CUT&Tag和ChIP-qPCR证实H3K18la直接结合CXCL16启动子区。FOXO3被鉴定为CXCL16转录因子，其自身启动子也受H3K18la调控。糖酵解调节剂可同步影响H3K18la、FOXO3和CXCL16表达。

靶向乳酸产生和组蛋白乳酸化抑制MPE进展

LDHA敲除成纤维细胞移植可减轻小鼠MPE负荷，改善生存，并逆转免疫抑制微环境（降低TNFR2⁺ T_reg比例，增强CD8⁺ T细胞功能）。药理学抑制乳酸产生或乳酸化修饰重现遗传干预效果。

结论与意义

本研究首次揭示了CAFs通过糖酵解-乳酸-H3K18la表观遗传轴调控CXCL16-CXCR6信号通路，驱动TNFR2⁺ T_reg细胞在MPE中特异性招募的完整机制。该发现不仅阐明了MPE免疫抑制微环境形成的新机制，更重要的是将代谢重编程（糖酵解）、表观遗传修饰（乳酸化）和免疫细胞招募三者有机联系，为理解肿瘤免疫逃逸提供了全新视角。靶向乳酸化修饰相关酶类（如AARS1）或可成为打破MPE免疫抑制的新型治疗策略，具有重要的临床转化价值。