为了改进用于定量生物成像的LA-ICP-MS校准标准的生产和计量特性分析的工作流程

生物印刷技术制备的凝胶滴定标尺在LA-ICP-MS生物成像中具有厚度均匀性（5% RSD）、元素均一性（<6% RSD）及长期稳定性（3个月RSD <6%），支持单线或多线采样以平衡分析时间与误差，为跨实验室数据可比性提供新方案。

　　
近年来，激光诱导火花质谱成像（LA-ICP-MS）技术在生物医学领域的应用显著提升，但其定量分析能力长期受限于校准标准的不足。传统校准方法依赖实验室自制的校准材料，导致不同研究间的数据可比性较差，难以满足临床诊断等对标准化分析高度敏感的需求。针对这一挑战，本研究提出了一种基于生物打印技术的多元素校准标准制备方案，并通过系统性实验验证了其性能与稳定性。

### 研究背景与核心问题
LA-ICP-MS在生物组织成像中展现出高灵敏度和分辨率，但实际应用中常面临校准材料缺乏统一标准的问题。尽管已有研究尝试通过调整基体材料（如聚合物或凝胶）或采用内部标准法优化性能，但现有方案仍存在以下局限性：
1. **校准材料不兼容**：部分方法依赖特定波长激光（如266 nm），限制了多中心研究的设备统一性。
2. **重复性不足**：手工制备的校准材料易受人为操作影响，导致批次间差异显著。
3. **稳定性风险**：传统校准材料在长期存储或运输过程中可能发生成分偏移，影响数据一致性。

上述问题严重制约了LA-ICP-MS在临床多中心研究中的推广。例如，肿瘤标志物的绝对定量分析需在不同时间、不同机构间实现数据可比性，而现有校准材料难以满足这一需求。

### 创新性解决方案
研究团队通过整合生物打印技术与多元素掺杂策略，开发出可重复利用的凝胶滴校准标准。其核心创新点包括：
1. **全流程自动化制备**：采用BioX6生物打印机以恒定压力（5 kPa）和重复率（50 Hz）打印含纳米颗粒的明胶溶液，生成55个/片的标准化凝胶滴阵列。每滴重量稳定在0.95 mg±0.03 mg（n=10片），干燥后表面积均值为5.90 mm2±0.13 mm2。
2. **多元素协同掺杂**：
- **性能监测元素**：Ti（质量浓度400 mg/kg）、Ce（60 mg/kg）、Au（30 mg/kg）用于仪器灵敏度优化和质谱参数调谐。
- **干扰控制元素**：Th（30 mg/kg）和U（30 mg/kg）用于监测激光诱导的元素分馏效应和氧化物生成。
- **临床应用元素**：Gd（0-90 mg/kg）和Yb（0-45 mg/kg）作为生物成像常用示踪剂，验证其定量准确性。
3. **标准化厚度控制**：通过椭圆偏振仪（精度±1%）测量干燥后凝胶滴厚度为1.98 μm±0.10 μm（n=12），厚度差异率<8%，确保激光完全气化（4 J/cm2能量密度）。

### 关键实验验证与数据
#### 1. 元素均匀性评估
通过LA-ICP-MS成像分析发现，所有掺杂元素的分布呈现高度对称性（图2）。以Yb为例，10×10像素网格内各子区域的浓度RSD值仅为4.8%，表明元素在空间分布上具有高度一致性。这种特性使得仅需蚀刻1行（105像素/行）即可获得代表整个凝胶滴的元素信号，相比传统全滴蚀刻法节省83%的分析时间。

#### 2. 稳定性测试
- **长期存储**：3个月后的元素浓度波动RSD<6%（表3），Gd和Yb的线性回归系数R2>0.99，表明未发生明显成分偏移。
- **运输稳定性**：经空运12个月后，凝胶滴元素分布仍保持稳定（RSD<5.8%），证明其抗环境干扰能力。

#### 3. 仪器性能验证
- **分馏效应**：U/Th同位素比值（平均99%）和氧化物比例（0.55%）显示分馏效应可忽略。
- **灵敏度范围**：通过Au（m/z 197）、Ce（m/z 140）、Ti（m/z 48）覆盖低（48-65）至高（197-238）质量区域，检测限达0.1 mg/kg（Yb）至5.4 mg/kg（Gd）。

### 技术优势与临床应用前景
1. **标准化制备流程**：生物打印技术使每小时可生产300片含55个标准滴的载玻片，批次间RSD<7.2%（表2），显著优于传统手工制备（文献报道RSD>15%）。
2. **多功能应用场景**：
- **仪器校准**：单滴即可完成多元素参数调谐，包含灵敏度监测（Ti-Au梯度）、氧化物抑制验证（Th-U体系）和干扰控制（Gd-Yb双标）。
- **质量控制**：每批次包含3个独立验证样本，支持实时监控仪器漂移。
- **跨平台兼容**：适用于266 nm、355 nm等多种激光波长系统。
3. **临床转化潜力**：与NIST 61X玻璃标准相比，生物相容性更优（明胶基体），且可通过添加Yb、Gd等生物示踪元素实现多模态成像（质谱成像+荧光成像）。

### 局限性与改进方向
当前研究未涵盖极端温湿度条件（如>40℃或>80%湿度）下的稳定性测试，且未验证多元素同时检测时的交叉干扰问题。建议后续研究：
1. 开发标准化温湿度存储协议（如NIST 150标准）
2. 增加元素组合（如Fe-Cr-Mn合金）测试基体匹配性
3. 探索3D打印技术实现多尺度组织模拟

### 结论
该研究成功构建了首个全自动化、多元素复合的LA-ICP-MS生物成像校准体系。通过纳米分散技术（如Gd/Yb碳点）和生物打印工艺，实现了元素浓度梯度可调（0-90 mg/kg）、空间分布均匀（RSD<6%）的标准化材料。长期稳定性测试表明，在标准存储条件下（20±2℃/50±5%湿度），校准材料稳定性可维持>12个月。这些突破性进展为建立国际通用的生物组织质谱成像标准奠定了基础，特别适用于肿瘤微环境示踪、药物代谢组学等临床研究场景。