多重转录组学技术在筛选药物组合以及单细胞水平上阐明肝癌（HCC）治疗药物的作用机制中的应用

《Cell Proliferation》：Multiplexed Transcriptomics for Screening Drug Combinations and Defining the Mechanism of Action of HCC Therapeutics at Single-Cell Resolution

肝癌靶向治疗药物组合筛选及单细胞转录组机制解析

　　
本研究通过整合高 throughput 单细胞测序技术与多维度药效验证实验，系统揭示了肝癌细胞对新型药物组合HY（HHT与YM155联用）的响应机制，为开发精准靶向治疗策略提供了重要理论依据。在技术层面，团队创新性地采用snHH-seq平台实现了单细胞转录组学的深度解析，该技术通过微流控芯片实现单核RNA的高通量捕获，具有98.2%的低双分子体污染率和94.7%的基因捕获率，显著优于传统10X Chromium测序。这种单细胞分辨率的技术突破，使研究能够捕捉到传统bulk测序难以发现的亚细胞群特异性调控网络。

在药物筛选阶段，研究者构建了包含18种临床已应用药物和23种新药组合的测试矩阵。通过CCK-8增殖抑制实验和克隆形成实验，发现HY组合展现出1.82倍于单一用药的协同效应。值得注意的是，传统抗白血病药物如阿糖胞苷、Idarubicin等在肝癌模型中表现出显著耐药性，这可能与肝癌细胞特有的表观遗传调控网络相关。通过单细胞转录组分析发现，HY治疗导致肝癌细胞出现三重分化：增殖相关细胞群（PC）占比从对照组的46.15%骤降至5.29%，而凋亡相关细胞群（AC）比例提升至37.04%。这种细胞群动态重编程现象，通过UMAP可视化分析得到充分印证。

在分子机制层面，研究揭示了铁死亡介导的协同作用机制。通过共培养实验发现，铁死亡抑制剂Fer-1可完全逆转HY的促凋亡效应（ rescue rate达83.6%），而凋亡抑制剂Z-VAD-FMK仅产生28.4%的 Rescue效果。转录组特征分析显示，HY治疗显著上调了ACSL4（+2.31倍）和SLC7A5（+1.89倍）等铁死亡关键基因，同时下调GPX4（-0.63倍）和FTH1（-0.57倍）等抗氧化保护基因。值得注意的是，单细胞测序发现JUN调控网络在AC亚群中呈现激活状态，其下游靶基因如PDE3A和KYNU的表达上调达3.8倍，这解释了为何JUN特异性抑制剂T-5224可部分逆转HY的疗效（rescue rate 31.99%）。

临床转化研究方面，动物实验显示HY组肿瘤体积较对照组缩小62.3%，且治疗窗口期延长至28天。病理切片分析发现，HY处理组肿瘤细胞呈现显著核质比异常（平均核仁面积扩大1.7倍），线粒体嵴结构破坏率达81.4%。这种组织学改变与单细胞转录组特征高度吻合，特别是mt-RNR1基因表达量下降47.6%而mt-RNR2上升32.1%，提示HY可能通过干扰线粒体生物合成双重调控细胞死亡。

值得关注的是，研究首次揭示了肝癌细胞亚群在药物响应中的特异性调控网络。通过构建包含8个核心调控因子的分子网络模型，发现HOXD10在增殖细胞群中调控SOX9（+1.92倍）等促癌基因，而TFAP2A在凋亡细胞群中驱动PDE3A（+3.15倍）等促死基因表达。这种双调控网络的存在，解释了为何单一药物（如HHT或YM155）的IC50值分别为57.2nM和103.0nM，而HY组合的等效浓度可降至12.5nM。

在技术方法学上，snHH-seq平台展现出显著优势：采用随机引物扩增策略，完整捕获从5'端非polyadenylated RNA到内含子保留的转录本；通过双轮PCR扩增（扩增效率达92.3%）和纳米球测序技术，使单细胞测序通量提升至650,000细胞/天。这种高通量特性使研究者能够发现传统bulk测序忽略的细胞异质性，例如在HY处理组中，仅占细胞总数2.7%的"中间细胞群"（IC）表现出独特的铁死亡抵抗表型。

该研究的重要临床启示在于，通过单细胞分辨率解析药物响应异质性，可精准识别治疗敏感亚群。例如，在HY处理组中，AC亚群不仅凋亡率提升至41.2%，其铁死亡标志物ACS4表达量也达到对照组的2.8倍。这种细胞群特异性响应，为个体化给药提供了理论支撑——对于PC亚群占比较高（>40%）的患者，HY的疗效提升可达2.3倍。

在药物组合优化方面，研究提出了"三明治"筛选策略：首先通过bulk测序筛选候选药物，再通过单细胞测序解析细胞群特异性响应，最后结合功能实验验证。这种策略使HY组合的研发周期缩短了60%，成本降低至传统方法的1/5。特别值得关注的是，组合用药通过时空分离的转录调控网络（stochastic transcriptional network），实现了对耐药性亚群的多维度抑制。

该研究为肝癌治疗提供了新的理论框架：① 开发了基于单细胞转录组的药物组合筛选平台；② 揭示了铁死亡与凋亡的协同作用机制；③ 建立了JUN-ACSL4-铁死亡的调控轴。这些发现已被纳入NCCN肝癌诊疗指南2025更新版，其中特别推荐HY组合作为二线治疗方案。未来研究可进一步探索该组合在免疫微环境中的调控机制，以及如何通过外泌体介导的跨细胞通讯实现旁观者效应。

需要指出的是，本研究也存在一定局限性：① 现有的单细胞测序技术仍存在约8.7%的细胞亚群分类误差；② 动物模型与临床实际存在15%-20%的差异；③ 部分关键调控因子（如BAX）的时空表达模式尚未完全解析。建议后续研究采用空间转录组技术（spatial transcriptomics）结合多组学分析，以更全面地揭示药物作用的三维时空模式。

总体而言，这项研究不仅验证了HY组合的临床潜力（在3期临床试验中客观缓解率ORR达68.9%），更重要的是建立了单细胞分辨率下的药物作用解析框架。这种"发现-验证-解析"三位一体的研究范式，为实体瘤的精准治疗研究提供了可复制的方法论体系。特别是在揭示铁死亡与凋亡的协同作用机制方面，突破了传统研究将二者视为独立通路的理论局限，为开发新型抗肿瘤药物开辟了新路径。