定向乳酸生产有助于减轻抗生素和抗性基因（ARGs）的污染

《Journal of Biotechnology》：Directional lactic acid production could mitigate antibiotic and ARGs pollution

本研究以动物粪便中常见残留抗生素磺胺氯吡嗪（SCP）和四种乳酸菌为对象，探究其降解率、途径及对耐药基因（ARGs）的影响。结果表明，LAB可显著降低ARGs水平，SCP降解率达84%-90.3%，不同LAB的降解途径存在差异但核心功能相似，中间产物毒性低于母体化合物，证实DLAP技术可有效缓解抗生素及ARGs污染。

　　
定向乳酸生产技术（DLAP）在动物粪便资源化利用中的抗生素降解与微生物互作机制研究

摘要
本研究聚焦于动物粪便中残留抗生素对定向乳酸生产技术（DLAP）的影响机制。通过构建四联菌种体系（保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌），系统评估了磺酰氯吡嗪（SCP）抗生素对乳酸菌活性及抗生素耐药基因（ARGs）的调控效应。实验表明，DLAP过程可有效降低ARGs丰度达30%-50%，其中 sul1（磺胺类）、sul2（磺胺类）、sul3（磺胺类）、sulA（氨基糖苷类）、intI1（β-内酰胺类）和 tnpA（四环素类）基因显著减少。SCP降解率在四类菌种中均达到84%以上，其中保加利亚乳杆菌表现最佳（90.3%）。研究揭示了抗生素代谢的多路径特征，包括硫原子氧化（S-N键断裂）、硝基还原（CH3释放）、亚硝基转化（SO2释放）等核心降解途径，同时发现中间代谢产物较母体化合物具有显著毒性降低特性。

研究背景
动物粪便作为重要有机废弃物，其定向乳酸发酵技术（DLAP）通过调控菌群代谢途径实现高附加值化学品（乳酸、乙酸）的同步生产。该技术结合了乳酸菌的溶菌作用、酶解反应和酸化过程，可同步实现有机质分解、环境污染物降解及生物材料生产的三重目标。然而，当前规模化应用面临抗生素残留污染的严峻挑战，全球每年约30万吨抗生素通过畜禽粪便进入环境系统（Wandee et al., 2021）。已有研究表明，β-内酰胺类抗生素可使乳酸菌产酸活性抑制达40%-80%（Pennacchio et al., 2016），而四环素类抗生素对乳酸菌的蛋白质合成具有显著抑制作用（Federici et al., 2014）。特别值得注意的是，在乳酸菌代谢过程中，抗生素不仅可能抑制目标菌的生长，更会通过基因水平转移引发耐药基因传播，这对技术安全性构成重大威胁。

实验设计
研究采用纯培养体系，以典型磺胺类抗生素SCP（浓度50 mg/L）和四大工业级乳酸菌（保加利亚乳杆菌CCAM214、嗜酸乳杆菌CCAM1414、植物乳杆菌CCAM43、干酪乳杆菌CCAM82）为研究对象。实验设置包含空白对照和梯度抗生素处理组，培养条件严格参照工业发酵标准：37℃恒温培养箱中150 rpm摇床振荡，初始接种量10^8 CFU/mL，发酵周期72小时。通过HPLC-MS/MS联用技术实时监测乳酸浓度及中间代谢产物，结合qPCR定量分析ARGs丰度变化。

技术突破
1. 抗生素降解机制创新
研究首次系统揭示DLAP体系中抗生素的立体降解机制。通过LC-MS代谢组学分析发现，SCP在乳酸菌代谢过程中经历七步核心反应：硫原子氧化（S-N键断裂）、硝基还原（CH3释放）、亚硝基转化（SO2释放）、羟基化（OH取代）、氨基释放（NH2生成）及碳氮键断裂（C-N键断裂）。其中，植物乳杆菌展现出独特的硝基还原能力，使SCP降解效率提升12.6%。

2. 耐药基因动态调控
采用qPCR和荧光原位杂交（FISH）技术联合分析显示，DLAP过程可使ARGs丰度显著降低。实验组较对照组ARGs总量减少37.8%，其中β-内酰胺类耐药基因（sul、intI1）下降幅度达42.3%。特别值得注意的是，乳酸菌代谢产生的乳酸（>50 g/L）和乙酸（>15 g/L）对ARGs具有协同抑制作用，其分子机制可能与质子梯度导致的DNA损伤修复抑制有关。

3. 安全阈值突破
研究首次确定DLAP技术的抗生素安全阈值：当SCP浓度≤50 mg/L时，四类乳酸菌仍保持85%以上的产酸活性。这一发现为实际工程应用提供了关键参数，表明在严格控制的发酵条件下，DLAP可有效处理含50 mg/L以下抗生素残留的畜禽粪便。

工艺优化方向
1. 菌种协同策略
实验发现干酪乳杆菌与植物乳杆菌的混合培养可使SCP降解率提升至93.7%，较单一菌种提高9.2%-14.5%。这种协同效应源于两种菌种在代谢路径上的互补性：保加利亚乳杆菌的糖苷酶可优先分解SCP分子骨架，而植物乳杆菌的硝基还原酶系则能高效转化中间代谢物。

2. 发酵参数优化
通过响应面法分析发现，最佳发酵参数组合为：接种量8.5×10^8 CFU/mL（误差±5%），pH值3.8（±0.2），温度36.5℃（±0.3℃）。在此条件下，SCP降解率可达91.2%，乳酸浓度稳定在52.3 g/L，且未检测到耐药基因转移事件。

3. 中间产物毒性控制
GC-MS分析显示，SCP降解过程中产生的3-氯-4-硝基苯酚（CNP）等中间产物较母体化合物毒性降低60%-80%。通过优化通风系统（CO2浓度控制在5%-8%），可有效抑制CNP的毒性累积，确保发酵系统稳定运行。

实际应用价值
本研究构建的DLAP技术体系为抗生素污染治理提供了新范式：通过筛选耐抗生素乳酸菌（如CCAM214对SCP耐受度达85 mg/L），建立多菌种协同降解机制，配合实时监测系统（每2小时在线检测SCN浓度），可实现畜禽粪便中抗生素的稳定降解（>90%）与乳酸同步生产（>50 g/L）。技术经济性分析表明，相较于传统化学处理，DLAP工艺的抗生素去除成本可降低42%，同时产生高附加值生物材料，具有显著的经济效益和环境效益。

研究局限与展望
当前研究主要基于纯培养体系，实际工程应用中需考虑复合菌群的环境适应性。建议后续研究重点关注：1）多菌种共培养条件下ARGs的水平转移抑制机制；2）工业化连续发酵中的抗生素残留动态变化规律；3）不同气候条件下DLAP技术的适用性优化。特别是针对北方寒冷地区（<10℃）的发酵效率提升，以及南方湿热环境下抗污染能力强化，这些方向将显著提升技术的工程化应用价值。

结论
本研究证实DLAP技术具有显著的抗生素降解与耐药基因调控能力，其核心机制在于乳酸菌代谢产生的有机酸（乳酸/乙酸）对ARGs的抑制作用与抗生素的化学降解协同作用。通过菌种优化（保加利亚乳杆菌为主）、参数调控（pH3.8-4.2）和过程监测（实时SCN浓度控制），可实现含50 mg/L SCP的畜禽粪便安全发酵，乳酸产率达85%以上，同时使ARGs丰度降低38%-52%。该成果为开发"四位一体"（有机质分解、抗生素降解、乳酸生产、环境友好）的粪便资源化技术提供了理论支撑，对保障食品安全、减少抗生素耐药基因扩散具有重要实践意义。