探索牛成肌细胞扩增后肌生成能力下降的机制以解决培养肉生产瓶颈

《Communications Biology》：Addressing hurdles in cultured meat by exploring reduced myogenesis after bovine myoblast expansion

本研究针对非基因修饰原代牛成肌细胞在培养肉大规模生产中面临的增殖与分化能力有限等生物学障碍，系统评估了胎儿与成年牛源成肌细胞的扩增极限与分化潜能。研究发现细胞可扩增超过30倍倍增，但经25倍倍增后肌管融合能力显著下降。通过转录组与蛋白质组学分析，揭示了低融合能力细胞中肌生成、DNA修复及钙信号通路等相关基因与蛋白的下调，为优化培养肉生产工艺提供了关键靶点与理论依据。

　　

随着全球人口增长和消费者对可持续蛋白质来源需求的提升，培养肉（Cultured Meat, CM）技术被视为传统畜牧业的重要补充。然而，该领域仍面临诸多挑战，其中细胞来源的生物学限制尤为突出。理想情况下，培养肉生产需从动物肌肉活检中分离原代卫星细胞（其增殖后代为成肌细胞），经大规模扩增后诱导分化形成富含蛋白质的肌纤维。然而，成年动物来源的成肌细胞存在固有的增殖与分化能力限制，这直接制约了培养肉的大规模工业化生产。特别值得注意的是，即使细胞能够实现大量扩增，其分化形成肌管的能力也可能提前丧失，导致无法模拟真实肌肉的纤维质地和蛋白组成。目前，关于牛成肌细胞，尤其是未经基因修饰的原代细胞，其确切的扩增极限以及分化能力随扩增进程的变化规律尚缺乏系统研究。由Maria Olenic、Aline Baekelandt、Charlot Philips、Florian Weiland和Lieven Thorrez共同完成的研究，旨在深入探究牛成肌细胞在扩增过程中肌生成能力下降的机制，为克服培养肉生产的关键瓶颈提供新见解。该研究发表于《Communications Biology》期刊。

为开展研究，作者团队运用了几个关键技术方法。研究使用的牛成肌细胞分离自比利时蓝牛（Belgian Blue）胎儿和成年个体的股二头肌活检组织。细胞在优化的增殖培养基（PM+，含bFGF和p38 MAPK抑制剂）中进行长期培养，以监测其增殖能力（通过群体倍增数评估）和分化能力（通过肌管融合指数评估）。通过流式细胞术分析细胞表面标志物CD56的表达以确定成肌细胞纯度，并采用β-半乳糖苷酶染色和流式细胞术检测细胞衰老。利用浅基因组测序分析高代次细胞的核型。核心机制研究部分，对具有高融合指数（HFI）和低融合指数（LFI）的增殖期成肌细胞进行了批量RNA测序（转录组学）和串联质谱标签（TMT）标记的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析（蛋白质组学），通过生物信息学方法（如差异表达分析、基因集富集分析GSEA、Ingenuity Pathway Analysis IPA、STRING数据库分析等）筛选差异表达的基因、蛋白质和信号通路。

结果

胎儿和成年牛成肌细胞的增殖能力

研究人员首先评估了原代牛成肌细胞的扩增潜力。分离自胎儿和成年供体的成肌细胞在优化的PM+培养基中可成功扩增。尽管胎儿组织初始分离获得的细胞数平均值高于成年组织，但统计学上无显著差异。长期培养显示，多个细胞系，尤其是来自成年供体的细胞，能够超越经典的Hayflick极限（约60次群体倍增），其中一个成年供体细胞系甚至达到了102次倍增。核型分析表明，即使经过大量扩增，细胞仍保持正常的染色体核型，未发现重大畸变。这表明原代牛成肌细胞具备满足大规模培养肉生产所需的扩增潜力。

扩增中胎儿和成年牛成肌细胞的融合能力

关键的分化能力评估显示，尽管细胞增殖能力强，但其融合指数（即能够融合形成肌管的成肌细胞比例）随着传代（或倍增次数增加）而显著下降。线性混合模型分析表明，融合指数随每次传代平均降低约6.81%。胎儿源细胞在早期传代表现出较高的融合能力，但与成年源细胞一样，在经过约25次倍增后，两者的融合能力均降至极低水平。这表明分化能力的丧失是扩增过程中的一个普遍且早于复制性衰老发生的现象。

扩增细胞中CD56+细胞比例

为探究融合能力下降是否由于非成肌细胞（如纤维脂肪组祖细胞）的过度生长所致，研究人员通过流式细胞术检测了成肌细胞标志物CD56的表达。结果显示，在传代早期（P1至P3），CD56+细胞比例维持在较高水平（92-94%），但在P6时有所下降，且成年供体间存在较大变异。值得注意的是，一个高倍增的成年供体细胞系在76次倍增时仍能保持98%的CD56+细胞比例，说明细胞纯度下降并非导致融合能力丧失的唯一或主要原因。

扩增成年细胞中β-半乳糖苷酶相关的衰老

研究人员通过β-半乳糖苷酶染色定量评估了细胞衰老。虽然在高代次细胞中观察到衰老细胞比例有所增加，且存在较大的供体间差异，但衰老细胞比例与融合指数之间并未发现显著相关性。这表明，在本研究体系下，β-半乳糖苷酶相关的衰老可能不是导致融合能力下降的关键因素。

低融合与高融合细胞的转录组差异

为了解融合能力差异的分子基础，研究人员对增殖期的低融合指数（LFI）和高融合指数（HFI）成年成肌细胞进行了批量RNA测序。差异表达分析发现了153个显著差异表达基因（DEGs），其中绝大多数（135个）在LFI细胞中下调。这些下调基因富集在与肌生成（如MYOG, MEF2C）、肌细胞融合（如MYMK, VCAM1）、肌节形成（如肌球蛋白重链/轻链异构体、结蛋白DES）相关的通路中。基因集富集分析（GSEA）和IPA通路分析进一步证实，HFI细胞中富集了肌生成、DNA复制与修复、端粒维持、钙信号通路和催产素信号通路等。相反，LFI细胞中上调的基因集与蛋白质合成（胞质翻译）和间充质向上皮转化等相关。相关性分析还发现，一些与G蛋白信号、离子运输、细胞粘附调节相关的基因表达与融合指数高度相关。

低融合与高融合细胞的蛋白质组差异

蛋白质组学分析结果与转录组数据相互印证。在增殖期成肌细胞中，鉴定出53个肽段（对应11种蛋白质）在LFI和HFI细胞间存在显著丰度差异。其中8种蛋白质（如结蛋白DES、多种肌球蛋白重链MYH2, MYH3, MYH8、肌球蛋白轻链MYL4等）在LFI细胞中丰度较低，这些蛋白质主要与肌肉收缩和肌动蛋白结合功能相关。STRING数据库分析和GO术语富集分析均强调了肌动蛋白细胞骨架组织和肌肉收缩过程的下调。在分化后的肌管样本中，未发现LFI与HFI组间的显著蛋白丰度差异，提示分化能力的差异在分化诱导前的增殖期细胞状态中已被决定。

讨论与结论

本研究系统评估了用于培养肉生产的牛成肌细胞的生物学限制。结果表明，无论是胎儿还是成年来源的原代牛成肌细胞，均具备超越预期的体外扩增能力，能够达到甚至超过理论估算的生产单头牛胴体等效细胞量所需的约30次群体倍增。然而，一个关键的挑战在于，细胞在扩增过程中会迅速丧失其分化形成肌管的能力，这种分化能力的丧失发生在复制性衰老之前。

机制探索表明，分化能力下降并非主要由非成肌细胞污染或β-半乳糖苷酶相关的典型衰老所驱动。多组学分析揭示了其背后的分子特征：低融合能力的成肌细胞表现出广泛的肌生成相关基因和蛋白（如肌生成调节因子、肌细胞融合因子、肌节结构蛋白）的下调。同时，DNA复制与修复机制、钙信号通路、催产素信号通路等重要生理过程也受到抑制。而一些可能抑制肌生成的通路，如HEY1信号通路和RHOGDI通路（可能通过LIMK2影响肌动蛋白重塑）则在低融合能力细胞中呈现上调趋势。这些变化共同导致了成肌细胞分化潜能的受损。研究还指出，持续在富含促有丝分裂因子的培养基中快速增殖，可能导致复制压力和相关DNA损伤的积累，进而非特异性地下调许多重要基因，这可能是分化能力丧失的一个重要诱因。

该研究不仅明确了培养肉生产中的一个核心生物学障碍，也为解决原发性细胞在组织工程和再生医学中普遍面临的质量衰减问题提供了重要线索。研究所识别的关键基因和通路（如HEY1、LIMK2、细胞内Ca²⁺稳态、催产素信号、DNA损伤应答等）为后续干预研究（如小分子抑制剂、生长因子调控、培养策略优化）提供了潜在的靶点。通过针对这些靶点进行干预，有望在保持细胞强大扩增能力的同时，维持或恢复其分化功能，从而推动培养肉技术向工业化生产迈出关键一步。研究强调，未来可能需要开发新的培养系统，模拟体内卫星细胞的不对称分裂和静息期，而非一味追求快速扩增，这可能更有利于维持成肌细胞的“干性”和分化潜能。