片段基药物设计发现新型细菌激酶抑制剂，可增强临床耐药菌株对氨基糖苷类抗生素的敏感性

《Communications Chemistry》：Fragment-based drug design of a bacterial kinase inhibitor capable of increasing the antibiotic sensitivity of clinical isolates

为应对日益严峻的抗菌素耐药性问题，研究人员聚焦于氨基糖苷类抗生素耐药关键酶——氨基糖苷磷酸转移酶（APH），开展了基于片段的药物设计（FBDD）研究。他们成功鉴定并表征了一种高效的ATP竞争性APH抑制剂（化合物83），该抑制剂在体外能有效抑制多种临床相关APH的活性，并能显著增强表达APH的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌临床分离株对卡那霉素A的敏感性。这项研究为开发与氨基糖苷类抗生素联用的新型增效剂提供了有前景的先导化合物。

　　

在人类与致病菌的漫长斗争中，抗生素的发现和应用曾一度让我们占据上风。然而，细菌通过进化出的各种耐药机制，使得许多曾经高效的抗生素逐渐失效。世界卫生组织（WHO）已将抗菌素耐药性列为全球健康的严重威胁。为了夺回优势，科学家们除了研发全新的抗生素外，另一个关键策略是“解除”细菌的武装，即抑制其耐药机制，让现有抗生素重新焕发活力。

氨基糖苷类抗生素（如庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星等）是治疗严重细菌感染的重要武器。但细菌可以通过产生修饰酶来使其失活，其中，氨基糖苷磷酸转移酶（APH）扮演了关键角色。这类酶能够利用细胞内的能量货币三磷酸腺苷（ATP），将一个磷酸基团转移到氨基糖苷类抗生素分子上，这个“磷酸化”修饰会改变抗生素的电荷和结构，使其无法再结合到核糖体靶点上，从而失效。由于APH的核苷酸结合位点与人类细胞中的蛋白激酶结构相似，此前有研究尝试用已知的蛋白激酶抑制剂来抑制APH，但效果有限或特异性不佳。因此，开发能够特异性抑制APH、并能有效恢复细菌对抗生素敏感性的新型抑制剂，是当前抗感染领域的一个重要研究方向。

这项发表在《Communications Chemistry》上的研究，由Julien Kowalewski、Robin Deutscher、Marion Richardoz、Mathilde Tomaszczyk、Muriel Gelin、Gilles Labesse、Felix Hausch、Gerard D. Wright、Catherine Dunyach-Remy、Jean-Fran?ois Guichou和Corinne Lionne*等研究人员合作完成。他们采用了一种名为“片段基药物设计”（FBDD）的现代药物发现策略。FBDD就像用乐高积木搭建复杂模型，先从分子量很小、结构简单的“片段”库中筛选出能与目标蛋白（这里是APH）微弱结合的初始片段，然后通过结构生物学手段精确解析片段与蛋白的结合模式，再以此为基础，像搭积木一样逐步添加化学基团进行优化，最终获得高活性、高选择性的先导化合物。

研究人员为开展此项研究，运用了几个关键的技术方法。他们首先通过热位移分析（TSA）和体外酶活性抑制实验对389个片段化合物进行了初步筛选。随后，利用X射线晶体学技术解析了关键片段及优化后的化合物与APH形成的复合物三维结构，从而在原子水平上揭示了抑制剂与酶的结合模式，为理性药物设计提供了关键依据。抑制常数（K_i）、半最大抑制浓度（IC₅₀）和解离常数（K_D）分别通过酶动力学实验、高效液相色谱（HPLC）分析和等温滴定量热法（ITC）进行测定，以量化化合物的抑制效能和结合亲和力。最后，研究的生物学效果在临床分离的耐药菌株（来源于法国尼姆大学医院和加拿大汉密尔顿总医院的微生物库）上得到验证，通过测定最低抑菌浓度（MIC）和绘制生长曲线，评估了先导化合物在恢复氨基糖苷类抗生素敏感性方面的潜力。

主要研究结果

初级片段筛选

研究团队以来自坎氏肠球菌（Enterococcus casseliflavus）的APH(2″)-IVa为初始模型，该酶的特点是既能使用ATP也能使用GTP作为磷酸供体，并能介导对多种临床常用氨基糖苷类抗生素的高水平耐药。他们对包含389个符合片段药物化学特征的化合物库进行了筛选（浓度500 μM）。通过分析化合物对酶热稳定性（ΔT_m）和体外酶活性的影响，最终筛选出43个有潜力的片段，命中率约12%，符合FBDD的典型特征。其中，氮杂吲哚（azaindole）是出现频率较高的优势结构。

鉴定与铰链区相互作用的支架

通过X射线晶体学分析，研究人员发现多个有潜力的片段都结合在APH的核苷酸结合位点，特别是与称为“铰链区”的关键区域发生相互作用。这些片段通常通过氢键与铰链区骨架原子（如Ile98）结合，其芳香杂环则通过π-π堆积与疏水残基（如Ile44, Ile216）相互作用。值得注意的是，在吡啶或7-氮杂吲哚骨架的特定位置（如5位）引入卤素原子（氯或溴），能显著提高抑制活性，晶体结构显示卤素原子指向结合位点深处的“看门人”残基Phe95，有助于稳定化合物的结合构象。基于这些结构信息，研究人员确定了三个主要的优化方向（向量）。

F69的向量3延伸带来新的相互作用

在针对先导片段F69（2-氨基-5-氯吡啶）的优化中，研究人员订购并测试了65个商业可得的类似物。其中，化合物36（在向量1上进行延伸）表现出较强的抑制活性（87%抑制率）。晶体结构显示，其苯乙基延伸部分与催化残基Lys46附近的疏水区域发生新的相互作用。通过等温滴定量热法（ITC）测定，化合物36与APH(2″)-IVa的亲和力（K_D）为28.2 ± 3.7 μM，并且酶动力学分析证实其为ATP竞争性抑制剂。尽管后续对36的进一步修饰（如引入酰胺键）未能显著提升抑制效力，但晶体结构揭示了这些衍生物可能诱导催化残基Asp217发生构象变化，类似于天然底物ATP结合时的状态。

5-氯-7-氮杂吲哚的向量3延伸极大提高抑制效能

研究重点转向了另一个更有潜力的支架——5-氯-7-氮杂吲哚（化合物2）。当在向量3（指向催化残基Lys46和Asp217的方向）进行优化时，获得了效果显著的提升。其中，化合物83（在向量3连接一个吡唑环）的抑制活性最强，其对APH(2″)-IVa的抑制常数（K_i）达到0.39 ± 0.04 μM，相比先导片段2提升了近6倍。晶体结构揭示了其高效的原因：吡唑环上的一个氮原子与一个被束缚的水分子形成氢键，该水分子进一步与关键催化残基Lys46和Asp217相互作用，形成了一个稳定的氢键网络；同时，吡唑环的另一个氮原子直接与Asp217侧链相互作用，使其朝向铰链区倾斜，这种相互作用网络稳定了抑制剂的结合。

先导化合物83对不同APHs的表征

研究人员进一步评估了化合物83对来自世界卫生组织（WHO）优先病原体清单中其他几种重要APH的抑制效果。结果显示，83能有效抑制APH(2″)-IVa、APH(3′)-IIa和APH(3′)-IIb（抑制率分别为95%, 76%, 91%），对APH(3′)-Ib和Ic的抑制效果中等。其对APH(3′)-IIb的IC₅₀为1.23 ± 0.04 μM，与对APH(2″)-IVa的IC₅₀（0.84 ± 0.13 μM）相当。ITC测定的结合亲和力（K_D）也很高，分别为APH(2″)-IVa: 1.06 ± 0.17 μM, APH(3′)-IIa: 1.25 μM, APH(3′)-IIb: 0.27 ± 0.05 μM。重要的是，晶体结构证实83在APH(2″)-IVa和APH(3′)-IIb中具有相似的结合模式，但与已知的哺乳动物蛋白激酶Erk-2中的结合模式不同，提示了其可能具有选择性。

先导化合物使临床细菌分离株对卡那霉素A更敏感

最关键的部分在于验证化合物83在细菌模型中的效果。研究在表达不同APH的临床分离株（铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌）上进行了棋盘法实验和生长动力学分析。结果表明，化合物83本身对细菌生长没有毒性（浓度高达500 μM即109 μg/mL时亦然）。但当与卡那霉素A合用时，83能够剂量依赖性地降低耐药菌对卡那霉素A的MIC，并显著延缓细菌的生长。例如，对于表达APH(3′)-IIb的铜绿假单胞菌C0307菌株（卡那霉素A MIC为64-128 μg/mL），在128 μg/mL 83存在下，MIC降至32 μg/mL。对于高度耐药（MIC = 4096 μg/mL）的表达APH(3′)-IIIa的金黄色葡萄球菌C0032菌株，在32 μg/mL 83和亚抑制浓度的亚胺培南（用于削弱细胞壁）存在下，MIC降至2048 μg/mL。生长曲线进一步显示，83能显著延迟细菌生长的起始时间并影响指数期的生长速率。

研究结论与意义

本研究成功地通过片段基药物设计（FBDD）策略，发现了一个高效、ATP竞争性的氨基糖苷磷酸转移酶（APH）抑制剂——化合物83。与文献中已报道的其他APH抑制剂（如异喹啉磺胺类CKI-7、黄酮醇槲皮素或吡唑并嘧啶类）相比，化合物83是首个并非已知蛋白激酶抑制剂的新型ATP竞争性APH抑制剂，其分子量较小，对多种临床相关的APH表现出微摩尔级别的抑制常数，并且在与氨基糖苷类抗生素联用时，能够在体外实验中有效增强临床耐药菌株的敏感性。

尽管化合物83在降低MIC绝对值方面效果尚属中等，且需要进一步优化以提高其效力（以便与细菌内毫摩尔浓度的ATP有效竞争）和细菌内的生物利用度，但这项研究无疑为开发针对细菌耐药酶的特异性抑制剂提供了强有力的概念验证和优秀的先导化合物框架。这种“抑制剂-抗生素”联用策略，有望成为应对日益严峻的抗菌素耐药性挑战的有力武器。正如β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素的成功联用一样，APH抑制剂与氨基糖苷类抗生素的联用前景值得期待。研究人员在伴随发表的另一篇手稿中进一步探讨了如何对该先导化合物进行化学修饰以增强其效力和生物利用度，同时保持其对人类细胞的低毒性。这项工作为后续开发能够逆转氨基糖苷类抗生素耐药性的临床候选药物奠定了坚实的基础。