成熟条件对不同凝固剂制备的冷冻豆腐的蛋白质构象和质量的影响

《LWT》：Effects of ripening conditions on protein conformation and quality of frozen tofu prepared by different coagulants

本研究系统探究了不同凝固剂（CaCl?、CaSO?、MgCl?）对冷冻豆腐蛋白质构象及品质的影响，发现-3℃ ripening（21天）显著增强硬度（CC组达15.6N，CS组9.8N，MC组8.9N），促进冰晶再结晶扩大孔隙，形成海绵状网络结构。蛋白质氧化、二硫键增加及疏水相互作用协同强化凝胶网络，β-折叠含量提升（CC组48.5%，CS组42.7%，MC组44.6%），水保持能力降低但弹性改善。结论：-3℃ ripening可优化冷冻豆腐品质，其中CaCl?凝固剂效果最佳。

　　
本研究聚焦于不同凝结剂（CaCl?、CaSO?、MgCl?）在-3°C与-21°C两种温度条件下的 ripening 过程对冷冻豆腐品质及微观结构的影响机制。通过系统分析豆腐的物理特性（硬度、弹性、咀嚼度）、水分保持能力、冰晶分布、蛋白质氧化及分子间作用力等关键指标，揭示了低温 ripening 在调控豆腐网络结构中的核心作用。

**1. 凝结剂特性与初始凝胶形成**
实验选用三种传统盐基凝结剂，其离子特性差异显著影响蛋白质凝胶结构。CaCl? 因高溶解度和快速释放 Ca2? 离子，促使大豆蛋白快速形成致密凝胶网络，初始硬度（13.54N）显著高于其他两组。CaSO? 作为低溶解度盐，缓慢释放 Ca2?，形成更均匀但略松散的凝胶结构，初始硬度（9.26N）次之。MgCl? 的较小离子半径（0.072 nm）与高电荷密度特性，导致 Mg2? 与蛋白质极性基团结合更紧密，形成初期较松散但弹性较好的凝胶（初始硬度8.06N）。这种差异为后续 ripening 效应提供了基础框架。

**2. 低温 ripening 对冰晶动态的重构作用**
在-3°C条件下，豆腐样品经历约21天的 ripening 过程后，冰晶发生有序再结晶。与-21°C直接冷冻相比，-3°C ripening 通过反复的冰晶生长与融化-再结晶过程，显著优化了孔隙结构。电子显微镜显示，CaCl? 组豆腐在 ripening 后形成直径50-100μm的均匀蜂窝状孔隙（图2a），而 MgCl? 组因冰晶生长不规律导致孔隙分布不均（图2b）。这种结构差异直接导致 CaCl? 组豆腐在相同 ripening 时间下，硬度比 MgCl? 组高76.73%（表2），其致密结构有效减少水分流失，WHC 保持率优于其他组别。

**3. 蛋白质网络重构的分子机制**
质构分析与流变学测试显示，所有凝结剂在-3°C ripening 时均出现硬度峰值（CC组15.60N，CS组9.80N，MC组8.92N）。这一现象与蛋白质-蛋白质相互作用增强密切相关。核磁共振（NMR）与红外光谱（FTIR）数据显示，随着 ripening 进行，β-折叠含量在6天后显著上升（CC组达49.84%），而α-螺旋比例下降（CC组从13.77%降至10.61%），表明蛋白质从有序的α-螺旋构象向无序的β-折叠结构转变，这种转变促进疏水作用与二硫键形成。具体而言：
- **CaCl?组**：快速形成稳定的离子桥，初期（1-6天）因冰晶生长导致蛋白质水合层破坏，WHC下降18.27%。但随 ripening 进行，冰晶再结晶压缩蛋白质网络，形成致密结构（图3a），使WHC在FM-15d达到稳定值（约68%），显著优于直接冷冻组（-21°C/21d WHC为61.16%）。
- **CaSO?组**：低溶解度特性导致Ca2?释放延迟，初期WHC下降幅度（17.34%）略低于CC组，但 ripening 12天后形成均匀薄层结构（图3b），其弹性（0.91）在三类中最高。
- **MgCl?组**：离子半径较小（0.072nm）的Mg2?与蛋白质极性基团结合更紧密，导致初期结构松散（初始硬度8.06N），但 ripening 9天后形成稳定网络（图3c），弹性提升14.81%。

**4. 水分分布与相态转变**
低场核磁共振（NMR）分析揭示，冻豆腐中水分存在三种相态：固定水（P?b）、结合水（P??）与自由水（P??）。-3°C ripening 组的P??比例显著高于-21°C直接冷冻组（图1g-i），表明低温波动促进水分在冰晶间隙的重新分布。例如，CC组在FM-15d时P??占比达37.2%，较初始状态（FS组P?? 28.5%）提升29.7%，这种水分相态转变直接导致硬度增加47.02%。

**5. 氧化与交联协同效应**
蛋白质氧化水平与网络强度呈现正相关。二硫键含量在 ripening 21天后较新鲜豆腐增加约24.2%（CC组），其中氧化应激引发的内源酶激活导致SH基团氧化（图4a）。电镜观察显示，这种氧化过程伴随着蛋白质亚基（如11S的A/B亚基）的聚集（图S3c），导致SDS-PAGE电泳条带密度增加。特别值得注意的是，MgCl?组在FM-9d时二硫键形成速率达峰值（+59.45%），与其离子半径小、电荷密度高的特性相关，这种高效交联机制使MC组弹性（0.81）在三类中保持最优。

**6. 工业化应用的关键参数**
研究建立了凝结剂-温度-时间的优化矩阵（表S1）。建议工业化生产采用以下策略：
- **凝结剂选择**：CaCl?适合追求高硬度的产品（如Q弹冻豆腐），CaSO?适合需要平衡弹性的产品（如日本Kori-tofu），MgCl?适合强调质地的差异化产品。
- **温度控制**：-3°C ripening比-21°C直接冷冻使硬度提升最高（CC组达47.02%），但需注意时间阈值：CC组超过15天 ripening会导致β-折叠比例下降（图5a），可能引发过度交联。
- **时间调控**：最佳 ripening 时间与凝结剂特性相关，CC组需15天，CS组12天，MC组9天，对应冰晶再结晶达到峰值强度时。

**7. 质量劣化的潜在风险**
研究同时揭示了过度 ripening 的负面效应（表S2）。当CC组 ripening 时间超过15天，WHC从68.4%降至63.2%，这与其β-折叠含量从49.84%降至45.95%相关，表明蛋白质过度聚集导致孔隙率下降。此外，所有组在FM-15d后均出现颜色黄变（b*值增加23-32%），主要源于脂质氧化与蛋白质褐变反应，这提示需在 ripening 过程中监控氧化指标。

**8. 技术创新与产业化启示**
本研究的核心创新在于建立低温 ripening 的动态调控模型（图6）。通过对比发现，-3°C ripening 相较于传统-20°C冷冻技术，能在相同时间内（21天）使蛋白质网络致密度提升40%以上，同时减少机械损伤导致的蛋白质降解。建议生产线采用梯度 ripening 策略：初期（0-6天）在-3°C促进冰晶生长，中期（6-15天）维持-5°C稳定结构形成，后期（15-21天）降至-2°C减缓氧化进程。此外，引入间歇性解冻环节（如-3°C→4°C循环）可进一步优化孔隙结构，使产品兼具弹性（弹性指数≥0.85）与良好水分保持（WHC≥65%）。

**9. 未来研究方向**
研究未覆盖动态 ripening 条件（如温度梯度、振动刺激），建议后续结合原位冷冻电镜技术，实时观测冰晶生长与蛋白质重构的时空关系。此外，针对工业化生产的连续化设备，需评估凝结剂浓度梯度（如CaCl?从20g/kg逐步降至10g/kg）对凝胶结构的动态影响，以及添加天然抗氧化剂（如茶多酚）对延缓蛋白质氧化的作用机制。

该研究为冷冻豆腐生产提供了理论支撑，证实低温 ripening 是通过冰晶再结晶驱动的蛋白质网络重构过程，该机制可推广至其他高水分蛋白制品（如冷冻酸奶、豆腐干）的工业化保存。建议在生产线中集成在线质构分析仪与近红外水分检测系统，实现 ripening 过程的实时监控与工艺优化。