人血浆循环小细胞外囊泡的标志 核心脂质特征的多组学鉴定：ADAM10与磷脂酰丝氨酸PS(36:1)作为新型生物标志物

《Nature Cell Biology》：Multi-omics identify hallmark protein and lipid features of small extracellular vesicles circulating in human plasma

【编辑推荐】本研究针对血浆中细胞外囊泡（EVs）的核心分子组成不清、难以与大量非EV颗粒精确区分这一难题，通过高分辨率密度梯度分离结合定量蛋白质组学（4500种蛋白）和脂质组学（829种脂质）分析，系统绘制了人血浆循环EVs的分子图谱。研究鉴定出182种核心蛋白（如ADAM10、STEAP23）和52种核心脂质（如PS、PIPs）作为EVs的标志性特征，并发现ADAM10蛋白与PS(36:1)脂质的组合能高精度区分EVs与非EV颗粒。这项研究为理解循环EV生物学提供了宝贵的分子资源，并对EV相关疾病的生物标志物开发具有重要意义。

　　

在人体错综复杂的循环系统中，除了红细胞、白细胞等常规细胞成分，还存在着数十亿计纳米级别的“信使”——细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）。这些由细胞释放的膜性小泡（直径约30-1000纳米），如同微观世界的瓶中信，携带蛋白质、脂质、核酸等活性物质，在细胞间穿梭，执行着免疫调节、器官间通讯、组织稳态维持等至关重要的生理功能，并与癌症、心血管疾病等多种病理过程密切相关。然而，尽管其生物学和生物医学意义重大，人类血浆中循环EVs的核心分子蓝图，尤其是构成其形态与功能基础的蛋白质和脂质组成，至今仍笼罩在迷雾之中。

理解循环EVs的保守分子组成具有深远意义。它不仅能够揭示循环EVs的基本构成单元，提供高置信度的分子图谱和相关生物通路，还有助于阐明EVs在人体内的生物发生、释放和摄取机制。更重要的是，由于从细胞培养系统获得的现有EV标志物在人类样本中保守性有限，鉴定出适用于人血浆的稳健EV标志物，将能推动大规模人群研究，改进EV纯化与表征技术，并为开发更安全的EV疗法提供信息。

近期发表于《Nature Cell Biology》的一项研究，旨在系统性解析人类血浆中循环EVs的核心蛋白质和脂质组成。研究团队对超过140份人血浆样本进行了高分辨率分离，以富集循环EVs，并利用质谱技术系统构建了其定量蛋白质组（4500种蛋白质）和脂质组（829种脂质）图谱。他们成功鉴定出一组高度保守的182种蛋白质和52种脂质，作为循环EVs的标志性分子特征。尤为重要的是，他们发现跨膜蛋白ADAM10和磷脂酰丝氨酸PS(36:1)能作为可靠的生物标志物，精确区分EVs与血浆中的非EV颗粒。这些发现为循环EV生物学提供了深入见解，并通过一个开源Shiny网络工具（evmap.shinyapps.io/evmap/）共享，将成为研究界理解循环EV生物学的宝贵资源库。

为开展此项研究，研究人员运用了几项关键技术。首先，他们采用高分辨率密度梯度分离技术从人血浆中富集小EVs亚型，并通过多种生物化学和生物物理方法验证EV的特性和分离纯度。其次，他们利用基于质谱的蛋白质组学和靶向脂质组学平台，分别对分离得到的血浆EVs和非EV颗粒进行了大规模、定量的分子谱分析。第三，他们开发并应用了机器学习算法，对获取的多组学数据进行深度挖掘，以识别能够区分EVs和非EV颗粒的关键分子特征。此外，研究还使用了表面生物素标记结合蛋白质组学来分析EVs的表面可及蛋白质，并通过TIM4亲和捕获等方法验证了特定标志物。研究所用血浆样本来源包括澳大利亚红十字生命血液、EDCAD研究和AusDiab试验队列。

从人血浆中分离循环EVs

研究团队采用自上而下的密度梯度分离方法，成功地从人血浆中富集了循环小EVs。Western blot分析显示，丰富的血浆成分如白蛋白、载脂蛋白和AGO2主要分布在DGS的1-5组分，而小EVs标志物CD63则集中在密度约为1.09 g ml^-1的6-8组分。冷冻电镜图像证实，富集到的pEVs是形态完整、膜包被的球形囊泡，平均直径约为220.4纳米，且带有净负电荷。与单独使用超速离心相比，该方法能更有效地分离EVs与非EV颗粒，从1毫升血浆中可获得约8.7微克pEVs蛋白，相当于约42亿个颗粒。

构建人类循环EVs的蛋白质组草图

通过对38个人血浆样本的pEVs进行蛋白质组学分析，研究定量了4631种蛋白质，其动态范围宽广，覆盖了大量低丰度循环蛋白。主成分分析显示，pEVs蛋白质组与非EV颗粒的蛋白质组存在明显差异。差异丰度蛋白在pEVs中富集了与小型EVs相关的术语/通路，而非EVs则富含补体和凝血通路成分。研究进一步鉴定出259种在全部38个pEV样本中均被定量到的“类别1”蛋白，其中182种在pEVs中显著富集的蛋白被定义为pEV蛋白特征。这些特征蛋白与囊泡运输、肌动蛋白细胞骨架调控等EV相关通路密切相关。

定义循环EVs的核心蛋白特征

研究发现，这182种pEV蛋白特征中，有151种是表面可及的，包括CD蛋白、整合素和膜联蛋白等。通过分析已发表的蛋白质组数据，证实这些pEV蛋白特征在多个血浆或血清EVs研究以及不同的EV亚群中高度保守。在一个独立的外部队列中的验证表明，177种pEV蛋白特征被检测到，其中87.4%在其相应的组分中显著富集，发现集和验证集之间蛋白特征的 fold change 显示出强正相关，强调了其跨人群的可重复性。

人类循环EVs的脂质组草图

研究使用靶向脂质组学平台分析了pEVs和非EV颗粒的脂质组。主成分分析显示两者的脂质组存在显著差异。pEVs和体外培养细胞来源的EVs中高度富集的脂质包括胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂等。超过30%的脂质在pEVs和非EVs之间存在差异丰度。富集于pEVs的脂质与EV生物发生相关，而非EVs中富集的脂质则主要是脂蛋白颗粒的成分。

循环EVs的核心脂质组

通过K均值聚类分析，研究确定了52种脂质作为pEV脂质特征，它们在与EV特征相关的脂质本体论术语中富集，如磷脂酰丝氨酸。相反，代表非EV脂质特征的114种脂质与脂质储存和脂滴相关。对血浆DGS各组分的脂质组学分析进一步验证了pEV脂质特征在EV富集组分中的特异性分布。

循环EVs的生物学蛋白和脂质标志物

研究利用机器学习算法验证了EV和非EV蛋白特征面板区分两者的能力，模型达到了97%的准确率。通过递归特征消除法，研究进一步确定了ADAM10蛋白以及PS(36:1)和CE(18:0)脂质组合作为区分EVs与非EV颗粒的最小特征集，具有强大的分类能力。实验验证表明，ADAM10在pEVs中普遍存在，并且与PS信号共同定位于一亚群pEVs上。

用于EV蛋白质组和脂质组数据的R/Shiny网络工具

为了促进数据的广泛利用，研究团队开发了一个开源的R/Shiny网络工具，允许用户快速查询其蛋白质组和脂质组数据集中的分子信息，评估特征保守性，并进行网络分析和通路富集分析。

本研究通过整合多组学分析，系统性地解析了人类血浆中循环EVs的核心蛋白质和脂质组成，鉴定出一组高度保守的分子特征。研究所定义的“标志性分子特征”，特别是ADAM10和PS(36:1)，为循环EVs的精确识别和质量评估提供了可靠的生物标志物。这些发现不仅深化了对循环EV生物学的理解，而且通过提供的丰富分子图谱和开源工具，为EV研究领域提供了宝贵的资源，有望推动EV在疾病诊断和治疗中的临床应用。