利用gH625细胞穿透肽增强修饰染色质的细胞内和经皮递送

《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》：Enhanced cellular and transdermal delivery of the modified chromatin using gH625 cell-penetrating peptide

非侵入性透皮递送系统开发。通过将细胞穿透肽gH625与合成组蛋白结合，构建新型递送平台。实验表明，该复合物在猪皮和鼠皮模型中实现242微米穿透深度，靶向真皮层且安全有效。连接组蛋白H2B的EGF保持生物活性，促进细胞增殖和胶原蛋白分泌，加速伤口愈合。该平台填补了皮肤靶向生物大分子递送的空白，为无创给药提供新方案。

　　

张行汉|梁玉欣|弗朗切斯科·佐恩塔|朴正贤

西安交通大学-利物浦大学生物科学与生物信息学系，江苏省苏州市，215123，中国

摘要

开发透皮药物递送系统必须克服当前皮肤渗透方法的有限效果和可靠性。本研究探讨了与细胞穿透肽gH625结合的合成染色质是否能够在保持货物生物活性的同时穿透表皮屏障。将gH625连接到组蛋白H2A并组装成染色质，用于递送DNA和肽类物质，而无需使用渗透增强剂。与野生型染色质相比，gH625-染色质使细胞渗透率提高了150％。体外猪皮模型和体内小鼠皮肤模型显示，在24小时内渗透深度增加了242微米，且信号仅限于真皮层，表明实现了安全的局部递送。组蛋白H2B C末端表达的表皮生长因子（EGF）保持了与游离EGF相当的活性，促进了细胞生长，增加了COL1A1的分泌，并加速了伤口愈合。这些发现建立了一个基于染色质的纳米平台，用于非侵入性透皮递送生物活性大分子，填补了皮肤靶向生物治疗递送领域的一个关键空白。

引言

DNA是一种高度负电荷的聚阴离子聚合物，没有专门的摄取机制，不易与细胞膜或皮肤结合或穿透。染色质可以被视为一种带有阳离子N端组蛋白尾部的浓缩聚阴离子DNA聚合物。¹有趣的是，四种核心组蛋白携带一个蛋白质转导结构域，有助于膜穿透。此外，这些核心组蛋白单独或组合使用，可以通过组蛋白介导的转导将DNA递送到哺乳动物细胞中。^2-7更重要的是，重组染色质能够通过非内吞途径将DNA递送到细胞中。⁸总体而言，组蛋白作为非病毒性DNA递送载体具有巨大潜力，因为它们能够浓缩核酸、形成稳定的纳米复合物，并通过组蛋白修饰靶向特定细胞。^9-11然而，组蛋白在哺乳动物体内的DNA递送应用面临许多挑战，例如确保组蛋白-DNA复合物的稳定性、可能的免疫原性以及与细胞内不稳定性和组蛋白介导的基因抑制相关的潜在基因表达问题。⁹

皮肤是人体表面积最大的器官，由于其非侵入性和便利性，成为透皮药物递送的理想途径。¹²因此，透皮递送在生物制药治疗中非常有吸引力；然而，由于几个主要障碍，只有少数药物获得了批准。^13-16最关键的挑战在于不透水的皮肤屏障，特别是表皮的角质层，这阻碍了大分子的被动局部递送。分子量超过500 Da的亲水性生物分子通常需要侵入性给药或使用微针和电穿孔等递送增强剂。¹⁷尽管采用了各种物理和生化方法，实现高效的透皮递送仍然是一个重大挑战。¹⁸因此，一个能够支持被动、局部递送并限制在真皮层内的递送平台，同时保持生物活性，将是对克服透皮递送主要障碍的重要进展。已经探索了多种细胞穿透肽（CPPs），通过形成共价或非共价复合物来递送治疗分子。^19-23其中一种肽gH625来源于单纯疱疹病毒I型的糖蛋白H，由于其疏水性氨基酸残基和两亲性α-螺旋结构，能够促进膜融合。^24-26先前的研究表明，gH625肽具有很强的膜插入和穿透能力。^24-29

基于gH625和组蛋白介导的转导的潜在协同作用，我们假设工程化合成染色质可以作为多肽和基因的有效透皮递送平台。在这里，我们证明了分子量超过10 MDa的CPP增强型合成染色质可以在不使用渗透增强剂的情况下实现透皮递送。该平台为递送蛋白质、肽类和核酸提供了一种多功能方法，具有在皮肤病治疗和护肤领域的潜在应用。

H2A N端与gH625肽的延伸有助于组蛋白的细胞穿透

核小体核心颗粒的晶体结构显示，组蛋白H2A的两个N端尾部采用无结构域，从核小体二聚体轴对称伸出。³⁰gH625肽直接融合到组蛋白H2A的N端（图1a），其中gH625区域在H2A的柔性N端尾部末端呈现α-螺旋构象（图1b）。先前的研究表明，H2A在细胞膜中的迁移能力最强

讨论

大分子的透皮递送面临重大挑战，主要是由于皮肤屏障的不透水性。本研究表明，含有两亲性细胞穿透肽gH625的合成染色质是一个有效的递送平台，能够在体外猪皮和体内小鼠模型中实现高效的细胞摄取和局部皮肤递送。据我们所知，这是首次报道工程化染色质化的DNA能够穿透皮肤

组蛋白八聚体的纯化和盐梯度染色质组装

pET3表达载体已被广泛用于野生型组蛋白的表达和纯化。³⁶使用GenScript Biotech Corp提供的序列通过DNA合成方法将gH625和EGF添加到组蛋白基因中（附录中提供了相关序列）。组蛋白八聚体的制备包含野生型组蛋白或野生型与修饰组蛋白的混合物，按照之前的方法进行。³⁵大规模染色质组装也是按照之前的方法进行的

CRediT作者贡献声明

张行汉：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，研究，正式分析，数据管理。梁玉欣：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，研究，正式分析，数据管理，概念化。弗朗切斯科·佐恩塔：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学，研究，正式分析，数据管理。朴正贤：撰写 – 原始草稿，监督，方法学，研究，正式分析，数据管理，

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢陈冠同、双森、徐文静和罗建安在蛋白质纯化和FACS分析方面的技术支持，以及朱秋杰在MD模拟方面的技术协助。我们感谢广东技术大学的动物设施对动物皮肤穿透活性的评估。本研究部分得到了XJTLU研究生研究奖学金对张行汉和梁玉欣的支持，以及XJTLU研究发展基金（RDF-23-01-026）对FZ的支持。