一种含有16种氨基酸的肽能够延缓肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型中运动神经元退化及其相关病理症状的进展

该研究通过鉴定肌细胞中NogoA过表达导致的运动神经元轴突生长抑制，发现外源性磷酸甘油酸激酶1（Pgk1）可减少磷酸化的Cofilin水平，抑制p-P38/p-Limk1-S323/p-Cofilin-S3信号通路，从而促进神经轴突生长。进一步筛选发现，Pgk1的345-360位16氨基酸短肽（FD-1和FD-2）在体外和动物模型中均具有与完整Pgk1蛋白等效的神经保护作用，可改善斑马鱼胚胎的异常轴突分支、延缓小鼠神经肌肉接头退化，并显著提高运动功能及生存期。

　　
### 中文解读：短肽FD-1和FD-2在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中的神经保护作用及机制

#### 1. 研究背景与机制探索
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种以运动神经元（MN）进行性 degeneration 为特征的神经退行性疾病。尽管近年来对ALS致病机制的研究取得一定进展，但药物开发仍滞后于基础研究。ALS的病理特征包括运动神经元轴突生长抑制、突触功能障碍以及神经炎症反应等。研究团队前期发现，外源性磷酸甘油酸激酶1（Pgk1）可通过非糖酵解途径与神经元表面的Eno2受体结合，抑制p-P38/p-Limk1-S323/p-Cofilin信号通路，从而促进轴突生长。然而，全长的Pgk1分子量较大（48 kDa），难以实现规模化生产。因此，本研究旨在筛选Pgk1的短肽片段，保留其神经保护功能。

#### 2. 短肽FD-1和FD-2的发现与结构特征
通过对Pgk1蛋白的连续切割筛选，研究团队发现其C端345-360氨基酸序列（共16个氨基酸）具有关键功能。进一步验证表明，该短肽片段既能抑制磷酸化Cofilin（p-Cofilin）的表达，又能促进神经细胞轴突延伸。为排除偶然性，研究还设计了一个功能无关的16-氨基酸对照肽（MSLSNKLTLDKLDVKG），结果显示其无法改善轴突生长，证实FD-1和FD-2的神经保护作用具有特异性。

#### 3. 体外实验验证短肽功能
（1）**轴突生长实验**：在NogoA过表达的小鼠成纤维细胞 conditioned medium（CM）中，NSC34神经细胞轴突长度被显著抑制（从101.7 μm降至53.6 μm）。而补充Pgk1或FD-1/-2后，轴突长度分别恢复至79.8 μm、89.2 μm和66.6 μm，接近正常水平（101.7 μm）。（2）**信号通路分析**：Western blot结果显示，Pgk1和FD肽能显著降低p-P38、p-Limk1-S323和p-Cofilin的表达水平（p<0.001），但对p-Limk1-T508无影响，表明其通过靶向p-P38/p-Limk1-S323/p-Cofilin通路发挥作用。（3）**氧化应激模型**：在外源性乙酰苯胺（EA）诱导的氧化应激下，SOD1-G93A突变NSC34细胞中p-Tau-S396和TDP-43异常累积。补充Pgk1或FD肽后，p-Tau-S396水平下降42%-55%，TDP-43胞质误定位比例从51.7%降至22.7%-27.5%，证实短肽可有效缓解氧化损伤。

#### 4. 体内实验模型验证
（1）**斑马鱼胚胎模型**：在C9orf72基因敲除或TDP43-G348C过表达的斑马鱼胚胎中，ICV注射FD-1/-2可显著增加尾神经节初级运动神经元（CaPMN）的分支数量（从对照组的13.3%提升至53.3%-46.7%）。同时，TDP43的胞质误定位比例降低50%以上，且轴突生长长度从正常值的109 μm缩短至83-85 μm后恢复至正常水平。（2）**小鼠模型**：在SOD1-G93A ALS小鼠中，静脉注射FD-1/-2每周一次，可显著改善以下指标：
- **握力测试**：120天时，对照组握力仅为初始值的55.8%，而FD-2组仍保持初始值的94.1%（p<0.001）。
- **运动功能**：124天时，对照组游泳距离仅307 cm，而FD-1/-2组分别达到745 cm和743 cm，接近健康小鼠水平（1067 cm）。
- **生存期**：平均生存期从对照组的119天延长至FD-2组的167天（p<0.001）。
- **脊髓运动神经元数量**：100天时，对照组仅存4.1±0.3个细胞，而FD-1/-2组分别保留9.3±2.4和12.5±1.8个细胞（p<0.005）。
（3）**突触连接完整性**：在注射FD肽的小鼠腓肠肌中，Synapsin 1（突触前标记物）与α-bungarotoxin（突触后乙酰胆碱受体标记物）的共定位率从对照组的40.1%提升至70.7%-79.3%（p<0.001），表明突触连接未被破坏。

#### 5. 作用机制与分子基础
（1）**Pgk1-Eno2相互作用**：研究证实，Pgk1的C端345-360序列（包含关键Arg353和Lys353残基）与Eno2受体的C端404-431区域（含Asp419）形成特异性结合，通过抑制p-P38和p-Limk1-S323的磷酸化，减少p-Cofilin表达。p-Cofilin的降低直接促进actin动态重排，促进轴突延伸。（2）**短肽的等效性**：FD-1（345-360）和FD-2（345-360，354位Ala→Pro突变）均保留与Eno2的相互作用界面，其中脯氨酸残基可能通过构象稳定增强肽-受体复合物的稳定性。尽管体外实验中FD-1对轴突恢复效果优于FD-2（89.2 μm vs 66.6 μm），但体内数据显示FD-2在生存期延长和运动功能改善方面更优，提示可能存在翻译后修饰或体内代谢差异。（3）**独立于糖酵解途径**：与Chaytow等研究发现的Pgk1内源性催化活性不同，外源性Pgk1和短肽均未影响细胞内ATP水平，且对糖酵解关键酶（如己糖激酶）无调控作用，进一步佐证其非糖酵解信号通路。

#### 6. 临床转化潜力分析
（1）**优势对比**：
- **生产成本**：短肽（16 aa）的合成成本仅为完整蛋白（417 aa）的1/10，且易于纯化。
- **生物利用度**：短肽在血液循环中半衰期延长（约2周），可减少给药频率。
- **靶向性**：通过脯氨酸的刚性结构，短肽可能更稳定地维持与Eno2受体的结合构象。
（2）**局限性**：
- **体内代谢差异**：在斑马鱼模型中，FD-1的神经保护效果优于FD-2，但在小鼠中却相反，提示可能需要优化给药途径（如ICV注射效率差异）。
- **长期安全性**：需进一步评估短肽的免疫原性和代谢产物毒性。

#### 7. 研究意义与未来方向
本研究首次将Pgk1的功能域缩小至16氨基酸序列，为神经退行性疾病治疗提供了新型工具。其科学价值体现在：
1. **机制突破**：揭示了外源性Pgk1通过轴突微丝动态调控（而非能量代谢）改善神经功能的新机制。
2. **模型创新**：斑马鱼胚胎模型和转基因小鼠模型的联合使用，实现了从细胞信号通路到整体行为学表征的多维度验证。
3. **转化前景**：短肽的化学稳定性（如添加乙酰化修饰）和递送方式（纳米颗粒包裹）可成为下一步开发重点。

未来研究可从以下方向深入：
- **结构优化**：利用AI预测技术优化FD肽的疏水-亲水平衡，提高血脑屏障穿透率。
- **联合疗法**：与TDP43稳定剂（如AT1001）联用，可能产生协同效应。
- **临床前研究**：开展大动物（如非人灵长类）实验，评估剂量依赖性和给药频率的最优方案。

#### 8. 结论
短肽FD-1和FD-2通过模拟外源性Pgk1与Eno2的相互作用，抑制p-P38/p-Limk1-S323/p-Cofilin信号通路，改善运动神经元轴突生长和突触功能。其疗效与完整蛋白相当，且具备更高的生产效率和更好的体内稳定性，为ALS治疗提供了可临床转化的新策略。该研究不仅验证了非经典Pgk1功能的科学假说，更为其他神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病）的靶向肽治疗开辟了新思路。