阐明Alg14在调控昆虫病原真菌Beauveria bassiana的细胞壁结构及生物功能中的作用

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Elucidating the role of Alg14 in governing cell wall architecture and biological functions in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana

本研究鉴定并表征了白僵菌Alg14同源物，发现其定位于内质网并与Alg13互作。敲除Alg14导致细胞壁N-和O-糖基化分别减少55%和11%，影响细胞壁完整性和抗逆性，同时负调控能量代谢，影响真菌发育及孢子毒力，揭示了Alg14的多功能作用，为生物农药工程提供理论依据。

　　

张龙斌|李宇天|杨志豪|崔周|关毅|刘光辉

中国福建省福州大学生物科学与工程学院

摘要

Beauveria bassiana是一种广用于农业害虫控制的昆虫病原真菌，其效力在很大程度上取决于细胞壁的精确结构。真菌细胞壁由多种糖蛋白和多糖组成，这些成分的合成通常由UDP-乙酰葡糖胺转移酶启动，该酶由Alg14和Alg13两个蛋白组成。然而，Alg14在昆虫病原真菌中的生化及生理功能尚未得到充分研究。在本研究中，我们发现了Beauveria bassiana中的一种新的Alg14同源蛋白，并通过其在内质网中的定位以及与Alg13的相互作用进行了验证。删除Alg14基因后，影响了Beauveria bassiana的氨基糖代谢和N-糖链生物合成途径。结果发现，ΔAlg14菌株的细胞壁蛋白中N-糖基化和O-糖基化分别减少了55%和11%，同时几丁质和多糖的含量也显著下降。这些变化削弱了细胞壁的完整性，并降低了真菌对细胞壁压力的耐受性。除了在细胞壁结构中的作用外，Alg14还负调控能量代谢（如NADH/NAD⁺比例和ATP的产生），从而影响真菌的发育和形态变化。Alg14还影响Beauveria bassiana孢子的质量、抗氧化能力和毒力。转录组分析和实验结果表明，Alg14调控的糖基化网络对真菌生理功能至关重要。本研究为Beauveria bassiana中Alg14的多重功能提供了新的见解，并为提高生物农药效力的基因工程策略提供了理论基础。

引言

化学农药的广泛和长期使用给农业生态系统带来了严重负担，导致环境恶化以及害虫抗性的增加（Bamisile等，2021年）。因此，农业界越来越多地转向环保替代品，其中Beauveria bassiana作为一种针对多种害虫的有前景的生物农药而受到关注（Wang等，2021年）。Beauveria bassiana的效力与其细胞壁的生化及生理特性密切相关（Zhang等，2017年；Zhang等，2020年），细胞壁既是抵御外部压力的关键屏障，也是宿主防御识别和逃避的关键接口（Ortiz-Urquiza和Keyhani，2015年）。例如，细胞壁中的β-1,3-糖链可以触发宿主免疫反应，从而降低Beauveria bassiana的毒力（Wang等，2024年）。此外，细胞壁糖蛋白对真菌的适应性和毒力至关重要，因为它们可以保护真菌内部免受损伤（Lecointe等，2019年；Mora-Montes等，2009年）。研究表明，细胞壁蛋白中N-糖链的减少会影响Fusarium oxysporum与植物和动物宿主的相互作用（Lopez-Fernandez等，2013年），以及Candida albicans和Cryptococcus neoformans的细胞壁完整性和毒力（Bates等，2006年；Thak等，2020年）。因此，参与N-糖链生物合成的基因在昆虫病原真菌中具有重要意义，尽管相关研究仍较为有限。

N-糖链的合成在真核生物界中具有保守性，其寡糖底物（Glc₃Man₉GlcNAc₂）在内质网（ER）膜上组装，利用长链磷酸（dol–P）作为载体（Lombard，2016年）。该过程首先由GlcNAc磷酸转移酶（GPT或Alg7）将N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）磷酸残基添加到dol-P上，形成GlcNAc-PP-dol。随后，UDP-GlcNAc转移酶再添加第二个GlcNAc残基，形成GlcNAc2-PP-dol（Gao等，2005年）。这个寡糖链进一步延长为Glc₃Man₉GlcNAc₂，并转移到蛋白质中的Asn-X-Ser/Thr保守序列中的天冬酰胺残基上（Lombard，2016年）。在Beauveria bassiana中，缺乏对N-糖链糖基化至关重要的甘露糖转移酶Alg9会导致真菌毒力缺陷（Song等，2021年）。显然，启动N-糖链合成的UDP-GlcNAc转移酶可能对Beauveria bassiana的效力更为重要。

UDP-GlcNAc转移酶由两个亚基Alg13和Alg14组成（Averbeck等，2007年；Averbeck等，2008年）。虽然已对真菌中的Alg13进行了大量研究，但关于Alg14的研究较少，主要集中在酵母上（Averbeck等，2007年；Bickel等，2005年；Gao等，2005年；Gao等，2008年；Lu等，2012年）。这些研究探讨了Alg14的蛋白质结构、相互作用蛋白、亚细胞定位及其在形成GlcNAc₂-PP-dol中的作用。迄今为止，尚未有研究报道真菌中的Alg14功能，更不用说其在昆虫病原真菌中的广泛作用了。鉴于Alg14的潜在重要性，本研究旨在表征Beauveria bassiana中的Alg14同源蛋白。我们的数据证实了其传统特征，并揭示了其在转录组变化、细胞壁糖基化、真菌发育和形态变化、抗氧化能力及毒力方面的多效性作用。这些发现为了解Alg14在昆虫病原真菌中的作用提供了新的见解，并为通过基因工程提高生物农药效力提供了理论基础。

部分内容摘要

微生物与培养条件

Beauveria bassiana的野生型（WT）菌株ARSCEF 2860来自美国农业部昆虫病原真菌收藏库（纽约伊萨卡）。常规培养和分生孢子生成在SDAY培养基（表S1）上进行，温度为25°C，光照周期为12小时/黑暗周期12小时。Czapek琼脂（CZA；表S1）用于基因操作和压力测试。Escherichia coli JM107和DH5α（Invitrogen，上海）在Luria-Bertani培养基中于37°C下培养以扩增质粒。Agrobacterium

Beauveria bassiana中Alg14的系统发育和时空特征分析

细胞壁糖蛋白及其N-糖基化是病原真菌的关键毒力因子（Bates等，2006年；Plaza等，2020年）。UDP-GlcNAc转移酶亚基Alg14对N-糖基化至关重要，但在Saccharomyces以外的真菌中研究较少（Lu等，2012年）。本研究在Beauveria bassiana基因组中发现了一个Alg14同源蛋白（EJP68490），其与其他真菌的同源蛋白的序列一致性为25.70–58.53%（图1A）。其身份通过进一步验证得到确认

结论

本研究对Beauveria bassiana中的UDP-GlcNAc转移酶亚基Alg14进行了功能分析。定位和相互作用分析表明，Alg14可能在内质网中与Alg13结合形成异源二聚体UDP-GlcNAc转移酶复合体。因此，Alg14对于GlcNAc的代谢及其在细胞壁中的修饰至关重要。删除Alg14基因后，细胞壁蛋白的N-糖基化和O-糖基化减少，从而影响了细胞壁的完整性

CRediT作者贡献声明

张龙斌：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据可视化，项目监督，资金筹集。李宇天：撰写 – 审稿与编辑，结果验证，实验研究。杨志豪：结果验证，方法学研究，实验研究。崔周：结果验证，实验研究。关毅：项目监督，资金筹集。刘光辉：资源协调，资金筹集。

资助

本研究得到了福建省自然科学基金（2025J01482和2023J01262）、福州大学启山学者基金（XRC-24067）以及福建省中青年健康专业人才重大研究资助（2021ZQNZD012）的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。