MICRO-TAG酶互补技术能够实现对细胞中药物与靶点结合情况的定量分析，尤其是在不同温度条件下的变化过程

《SLAS Discovery》：MICRO-TAG enzyme complementation enables quantification of cellular drug-target engagement in temperature series

药物发现中，传统生物物理方法因在细胞外环境评估靶点结合而受限。本文提出基于分体RNase S酶补全的MICRO-TAG荧光系统，通过温度梯度程序动态监测药物-靶点结合，突破单一Tagg50依赖，实现多态性靶标结合事件的量化分析。实验验证了该方法在MAPK1、KRAS G12D和UBE2N等 challenging靶点上的高灵敏度和适用性，EC50_total分别为1.0nM、19nM和322nM，与已知药效数据一致。该技术整合了实时荧光检测与可控温度程序，显著提升药物筛选通量和自动化水平。

　　
本文介绍了一种基于荧光标记的细胞目标结合（Cell Target Engagement, CTE）方法，称为MICRO-TAG系统。该技术通过利用分体RNA酶S的酶补全原理，结合实时荧光检测和温度梯度扫描，实现了对药物与靶标结合过程的高灵敏度、高通量和可扩展化分析。

### 一、技术背景与挑战
传统生物物理方法（如表面等离子共振SPR、微尺度热迁移MST）在评估药物与靶标结合时存在局限性：1）依赖重组纯化蛋白，无法模拟细胞内复杂环境；2）仅检测单一温度下的结合效果，无法捕捉靶蛋白的多态性构象变化。例如，当靶标蛋白存在多个结合位点或构象异构体时，单一温度点分析可能导致信息缺失。

MICRO-TAG系统的创新在于将以下技术整合：
1. **分体酶补全原理**：通过将RNA酶S的15氨基酸S标签固定到目标蛋白上，与外源提供的S蛋白大亚基结合形成功能性酶，催化荧光底物的切割反应。
2. **温度梯度扫描技术**：利用实时荧光检测仪（如qPCR系统）的编程升温功能，在40-70℃范围内进行多温度点扫描，突破传统CTE方法依赖单一T agg50温度的限制。
3. **动态构象监测**：通过温度变化诱导目标蛋白的构象转变，实时记录荧光信号变化，可捕捉从亚稳态到完全溶解的多阶段结合过程。

### 二、方法学创新
#### 1. 系统构建
- **表达体系**：采用pcDNA1载体将S标签（KETAAAKFERQHMDS）克隆到目标蛋白的N端或C端，在HEK293细胞中瞬时表达。
- **检测组件**：包含S蛋白（经大肠杆菌BL21表达纯化）、FRET荧光底物（6-FAM-dArUdAdA-6-TAMRA）和缓冲液。S蛋白的热稳定性经验证可耐受60℃以上高温，确保温度扫描实验的有效性。

#### 2. 工作流程优化
- **非细胞溶解裂解**：使用1% Triton X-100温和裂解细胞，保持目标蛋白的天然构象。
- **实时信号监测**：在PCR仪式检测平台进行温度扫描（升温速率1.6℃/秒），每个温度点停留3分钟以建立热力学平衡，随后在25℃恒温条件下检测荧光信号。
- **数据处理模型**：采用AUC（曲线下面积）和斜率双参数分析，通过加权算法整合多温度点数据（公式1-9的数学处理转化为动态信号分析模型）。

#### 3. 关键性能指标
实验验证了方法的可靠性：
- **Z'因子**：MAPK1（0.78）、KRAS（0.74）、UBE2N（0.79），均大于0.6的优质标准
- **信号噪声比**：最低19.65（UBE2N），最高15.1（MAPK1）
- **背景干扰**：DMSO对照组与实验组信号分离度达3.8-24.7倍（MAPK1）

### 三、应用案例与结果分析
#### 1. MAPK1靶点验证
- **实验设计**：使用AZD0364（已知MAPK1抑制剂）和R-Crizotinib（对照）进行剂量梯度测试。
- **温度响应特征**：
- 50-60℃区间：AZD0364使MAPK1热稳定性提升（T agg从54℃升至61℃）
- 65℃以上：信号平台期差异显著（图3C显示在55℃时信号分离度达8.7×10^5 RLU）
- **定量分析**：
- 单温度EC50：50℃（3.2nM）、55℃（0.6nM）、60℃（1.3nM）
- 整合EC50总值：1.0nM（与文献报道一致）

#### 2. KRAS突变体选择性检测
- **实验设计**：比较MRTX-1133对G12D突变体与野生型KRAS的作用。
- **温度响应特征**：
- 40-55℃区间：G12D与野生型EC50分别为19nM（40℃）和1.2μM（55℃）
- 信号分离度达24.7倍（图4C）
- **选择性分析**：突变体抑制活性比野生型高1000倍（与文献报道一致）

#### 3. UBE2N共价结合检测
- **实验设计**：使用UC-764865（共价抑制剂）和PO1788（结构类似物对照）。
- **温度响应特征**：
- 55-65℃区间：EC50从1.6μM降至241nM
- 信号动态范围达2202倍（图5C）
- **机制验证**：共价结合导致靶蛋白不可逆修饰，热稳定性显著高于对照

### 四、技术优势与局限性
#### 1. 核心优势
- **多态性检测**：通过温度扫描可区分靶蛋白的亚稳态构象（如MAPK1在50℃-60℃间的3种构象状态）
- **高通量兼容**：适配96孔板格式，单次实验可完成30+化合物同时检测
- **成本效益**：相比传统CTE方法（需预确定T agg50），节省约40%实验时间
- **机制洞察**：可识别不同温度下的结合模式（如KRAS在40℃-55℃间的2阶段结合）

#### 2. 局限性
- **底物渗透性**：FRET底物在细胞内的渗透率有限（需优化载体表达效率）
- **温度范围限制**：60℃以上可能导致某些靶蛋白不可逆变性
- **数据分析复杂度**：需建立多温度点权重模型（如公式8-9的加权算法）

### 五、应用前景
1. **药物发现阶段**：
- 替代传统体外纯化蛋白检测（节省70%实验样本）
- 发现新型靶标（如KRAS G12D突变体）
- 评估共价抑制剂（如UC-764865）的稳定性

2. **机制研究**：
- 捕捉动态结合过程（如MAPK1的3种构象转换）
- 检测非经典结合模式（如UBEn2的共价结合诱导的构象变化）

3. **临床转化**：
- 开发基于细胞环境的生物标志物
- 优化抑制剂设计（如KRAS抑制剂选择性提升1000倍）

### 六、技术扩展方向
1. **多参数检测**：整合光谱成像技术（如EVOS M5000）实现活细胞动态成像
2. **自动化升级**：开发自动化的96孔板处理系统（已减少人工操作步骤60%）
3. **新型底物开发**：研究pH响应型底物（当前底物pH稳定性在6.5-7.5）
4. **高通量筛选**：适配Tecan HTS平台，实现每天2000+样本检测

### 七、总结
MICRO-TAG系统通过以下创新解决了传统CTE方法的瓶颈：
1. **动态温度扫描**：覆盖目标蛋白的热力学分布范围（40-70℃）
2. **双参数分析模型**：结合AUC和斜率分析（Slope-based Δm值与AUC-based EC50总值的互补）
3. **通用酶补全系统**：15氨基酸S标签兼容90%以上分泌蛋白

该方法在MAPK1、KRAS、UBE2N等复杂靶点的验证中展现出：
- 最低检测限达0.1nM（R-Crizotinib对MAPK1）
- 信号动态范围达2200倍（UBE2N）
- 10分钟内完成全温度系列扫描

未来可结合单细胞分析（通过微流控技术）和人工智能预测（训练温度响应模型），进一步提升其在精准医疗和药物开发中的应用价值。该技术已成功纳入多个跨国药企的早期发现平台，实验周期从传统方法的14天缩短至72小时。