传统奶酪成熟环境中微生物生物膜的空间与功能分化研究

《Scientific Reports》：Spatial and functional differentiation of microbial biofilms in a traditional cheese ripening environment

本研究针对传统奶酪成熟环境中微生物生物膜群落结构不清、功能未知的问题，通过高通量16S rRNA和ITS测序技术，揭示了墙壁与天花板生物膜在微生物组成和预测功能上的显著差异。结果表明，墙壁生物膜具有更高的分类学和功能多样性，富含异养、发酵和聚合物降解类群；而天花板生物膜则预测富集好氧、耐胁迫及潜在产甲烷菌系。该研究为理解传统食品环境中微生物适应与生态韧性提供了新见解。

　　

在食品工业中，传统奶酪成熟地窖代表着一种独特的人造生态系统。这些环境通常拥有百年以上的历史，由砖石结构构成，并维持着低温（约10°C）、高湿度（约85%）和弱光照的稳定微气候，条件类似于天然的地下栖息地（如洞穴）。在这样的环境中，微生物在墙壁和天花板表面形成稳定的生物膜。生物膜是微生物为适应环境而发展出的一种高度组织化的生存策略，能提供保护、促进合作，并确保在变化条件下长期存活。然而，尽管医疗和工业领域的生物膜研究已较为深入，但对于传统奶酪地窖这类食品相关建筑环境中，表面附着的微生物群落，其组成、功能以及空间分布规律却知之甚少。特别是表面材料（石材 vs. 砖块）和空间位置（墙壁 vs. 天花板）对生物膜组成和功能的影响，更是研究中的空白点。理解这些微生物群落的生态学，不仅关乎建筑材料的保护，更可能直接影响奶酪成熟的质量与安全，因为这些环境微生物构成了所谓“微生物风土”的一部分。因此，探究传统奶酪成熟环境中生物膜的空间和功能分化，具有重要的科学意义和应用价值。

针对上述问题，由Weronika Goraj等人组成的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项研究，旨在阐明一个19世纪波兰传统奶酪成熟地窖中，墙壁和天花板表面微生物生物膜的群落结构、预测功能及其生态网络特征。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术：首先，从具有宏观生物定殖证据的墙壁（砖和石材质）和天花板（砖材质）表面采集了生物膜样本，并测定了其pH、氧化还原电位（Eh）、电导率（EC）及多种营养元素含量等理化参数。其次，通过高通量测序技术，针对细菌的16S rRNA基因V3-V4高变区和真菌的内源转录间隔区（ITS）进行扩增子测序，使用Illumina MiSeq平台获得序列数据。接着，利用QIIME 2生物信息学平台和DADA2算法进行数据处理，包括扩增子序列变异（ASV）推断、物种分类学注释（细菌使用SILVA数据库，真菌使用UNITE数据库）以及α和β多样性分析。此外，还利用FAPROTAX数据库对细菌群落进行功能预测，利用FunGuild数据库对真菌进行功能 guild 预测。最后，通过共现性网络分析来揭示微生物类群间的潜在生态相互作用。

3.1. 生物膜样品的理化特性

研究首先分析了不同来源生物膜样品的理化性质。结果表明，样品的理化特性与其基底材料（砖或石）密切相关。所有样品均呈碱性反应（pH > 7.8），无机碳占总碳的比例很高（81-90%），并富含钾、钙、铁等碱金属和碱土金属。值得注意的是，天花板上的一个砖样本（PD_B3）含有非常高浓度的盐分（EC = 122.6 μS cm^-1）以及最高水平的铵态氮（N-NH₄）、镁和钾，形成了一个独特的微生物栖息微环境。这些理化参数的差异为解释微生物群落的差异提供了环境背景。

3.2. 微生物群落结构

Alpha多样性分析显示，墙壁生物膜（无论是砖还是石材质）的细菌和真菌多样性均高于天花板生物膜，其中石墙生物膜（PD_B2）的多样性最高。Beta多样性分析（包括主坐标分析PCoA）进一步证实，微生物群落组成在墙壁和天花板样本之间存在显著差异。墙壁样本（PD_B1和PD_B2）在群落组成上更为相似，而天花板样本（PD_B3和PD_B4）则彼此差异较大，且与墙壁样本明显分离。

在物种分类上，细菌群落中，放线菌门（Actinobacteriota）在天花板样本中占绝对优势（最高达93%），而在墙壁样本中，假单胞菌门（Pseudomonadota，即以前的变形菌门Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）的比例较高（分别可达39%和35%）。在属水平上，天花板生物膜显著富集了Amycolatopsis、Pseudonocardia和微球菌目（Micrococcales）的未分类成员等放线菌；而墙壁生物膜则主要由黄杆菌科（Flavobacteriaceae）、Balneolaceae、Halomonas和Salinisphaera等类群主导。真菌群落中，子囊菌门（Ascomycota）在所有样本中均占主导地位（58-96%），但墙壁生物膜含有更高的Mortierellomycota和Rozellomycota比例，并且富含枝顶孢属（Acremonium）、枝孢属（Cladosporium）等；而天花板生物膜则含有更高比例的未分类真菌和肉座菌目（Hypocreales）未定属。冗余分析（RDA）表明，电导率（EC）、pH和氧化还原电位（Eh）是驱动微生物群落变异的关键环境因子。

3.3. 生物膜中微生物功能的预测

对细菌群落的功能预测（FAPROTAX）揭示了墙壁和天花板生物膜之间明显的代谢潜能差异。墙壁生物膜预测具有更高的化学异养、好氧化学异养、发酵、硝酸盐还原、木聚糖分解和几丁质分解等功能，这表明其在有机物周转和营养循环中扮演重要角色。相反，天花板生物膜则预测富集了产甲烷作用（尤其是氢营养型产甲烷）和亚硝酸盐呼吸等功能，暗示其内部可能存在局部厌氧微环境。真菌的功能预测（FunGuild）显示，墙壁生物膜中的真菌群落功能多样性更高，以腐生营养、内生菌以及兼具多种营养模式的类群为主；而天花板生物膜的真菌功能相对单一。

3.4. 生态网络

对最常见ASVs的共现性网络分析显示，墙壁生物膜中的细菌和真菌群落均形成了更复杂、连接更紧密的网络结构。细菌网络中，放线菌门、假单胞菌门和拟杆菌门的类群形成了高度互联的集群，表明它们之间存在潜在的互补相互作用，例如在有机物降解和代谢物交换方面。像Pseudonocardia和Amycolatopsis这样的放线菌可能作为关键类群（keystone taxa）在生物膜结构和功能稳定性中发挥核心作用。真菌网络也显示出类似的趋势，墙壁生物膜中的真菌类群关联性更强。这些网络结构特征表明墙壁生物膜可能代表着更稳定、生态上更成熟的微生物联合体。

本研究通过综合运用环境微生物学、分子生态学和生物信息学方法，系统地揭示了一个传统奶酪成熟地窖中墙壁与天花板表面微生物生物膜在群落结构、预测功能和生态网络上的显著空间分化。研究结论强调，墙壁生物膜，尤其是石质墙壁上的生物膜，支持着更高多样性和更复杂生态相互作用的微生物群落，其功能偏向于异养和发酵代谢，可能与奶酪成熟过程有更直接的相互作用。而天花板生物膜则可能受限于不同的微环境条件，群落结构更简单，功能上显示出潜在的厌氧代谢特征。这种空间分异是由pH、Eh、EC等关键环境因子通过生态过滤作用塑造的。

该研究的意义在于，首次详细刻画了传统奶酪成熟环境中空间异质性对微生物生物膜群落和功能的影响，将此类食品加工环境视为研究建筑环境中微生物生态学的半天然模型系统。研究成果不仅增进了我们对特定食品环境中微生物适应和功能专业化的理解，也为评估和管理传统食品生产环境的微生物质量、乃至保护和利用文化遗产建筑中的微生物资源提供了新的科学依据。尽管基于有限的样本量和预测性功能分析，这项研究为未来开展多地点比较、宏基因组/宏转录组验证以及长期监测研究奠定了重要基础。