壳聚糖纳米粒负载利巴韦林、卡铂和百里香精油通过下调SNQ2/ERG11/CDR1/MDR1基因增强抗念珠菌活性研究

《Scientific Reports》：Chitosan nanoparticles loaded with ribavirin, carboplatin, and thyme oil downregulate SNQ2, ERG11, CDR1, and MDR1 in Candida strains

本研究针对念珠菌耐药性日益严重的临床挑战，开发了负载利巴韦林(RBV)、卡铂和百里香精油(TV EO)的壳聚糖纳米粒(CS-NPs)。研究人员通过离子凝胶法制备了粒径约286-298 nm、zeta电位+33-34 mV的球形纳米粒，封装效率达81%-91%。体外实验表明，纳米制剂显著降低了白色念珠菌和热带念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)，并有效下调耐药基因SNQ2/ERG11/CDR1/MDR1的表达。该研究为克服真菌耐药性提供了新型纳米给药策略。

　　

随着广谱抗生素的广泛使用、留置导管技术的普及以及免疫抑制患者的增加，侵袭性真菌感染的发病率和死亡率在全球范围内持续攀升。其中，念珠菌属真菌作为重要的机会性致病菌，已成为医院感染的主要元凶之一。更令人担忧的是，近年来非白色念珠菌(NCAC)菌株的感染比例显著上升，这些菌株往往对常用抗真菌药物表现出更强的耐药性，给临床治疗带来了严峻挑战。

在众多念珠菌物种中，光滑念珠菌(C. glabrata)和热带念珠菌(C. tropicalis)尤为引人关注。光滑念珠菌虽然缺乏菌丝发育和蛋白酶分泌等传统毒力因子，但其先天耐药性和生物膜形成能力使其在免疫缺陷患者中成为难以清除的病原体。流行病学调查显示，光滑念珠菌引起的系统性念珠菌感染约占15%，且在重症监护室(ICU)中的流行率呈现全球上升趋势。热带念珠菌则是血液系统恶性肿瘤、实体瘤患者及移植受者中念珠菌血症和侵袭性念珠菌病的主要致病菌，其耐药性问题也日益突出，对唑类和棘白菌素类药物的耐药率不断攀升。

面对这一严峻形势，传统的抗真菌药物显然力不从心。唑类耐药性主要源于药物外排泵的过表达和药物靶点的突变。在光滑念珠菌中，SNQ2基因编码的ABC转运蛋白能够将药物排出细胞外，降低细胞内药物浓度；ERG11基因编码的羊毛甾醇14α-脱甲基酶是唑类药物的主要作用靶点，其突变会降低药物结合能力。在热带念珠菌中，CDR1和MDR1基因分别编码ABC转运蛋白和主要易化子超家族(MFS)转运蛋白，它们的过表达是氟康唑耐药的重要机制。

为突破这一困境，来自德黑兰Tarbiat Modares大学的研究团队将目光投向了纳米技术。他们创新性地利用天然多糖壳聚糖(CS)制备纳米粒(CS-NPs)，并负载三种不同性质的活性成分：抗病毒药物利巴韦林(RBV)、抗癌药物卡铂以及百里香(T. vulgaris)精油(TV EO)。壳聚糖纳米粒具有生物相容性好、可生物降解、自带抗菌活性等优势，其表面正电荷还能与带负电的微生物表面发生静电相互作用，有望绕过常见的耐药机制。相关研究成果发表在《Scientific Reports》期刊上，为抗真菌药物研发提供了新思路。

研究人员采用了几项关键技术开展本研究：通过离子凝胶法合成三种纳米制剂(CS-R-NPs、CS-C-NPs、CS-TV-NPs)，并利用动态光散射(DLS)、电泳光散射(ELS)和透射电镜(TEM)进行表征；通过MTT法评估纳米粒对成纤维细胞的细胞毒性；按照CLSI-M27-A3/S4指南通过微量稀释法测定纳米制剂的最小抑菌浓度(MIC)；通过qRT-PCR定量分析耐药基因表达变化。实验所用20株临床分离株(包括10株C. glabrata和10株C. tropicalis)来源于Tarbiat Modares大学菌种保藏中心。

物种鉴定和念珠菌分离株的抗真菌敏感性

研究人员首先对临床分离株进行了氟康唑敏感性测试。结果显示，所有10株光滑念珠菌均对氟康唑完全耐药，MIC₅₀和MIC₉₀值分别为64μg/mL和128μg/mL。热带念珠菌菌株的耐药率也高达90%，MIC₅₀和MIC₉₀值分别为16μg/mL和32μg/mL。这一结果凸显了临床上面临的严重耐药问题。

CS-NPs的理化表征

纳米粒的封装效率(EE%)评估显示，CS-R-NPs、CS-C-NPs和CS-TV-NPs的封装效率分别为86%、81%和91%。DLS测量显示三种纳米粒的流体动力学直径约为286-298 nm，ELS测量显示zeta电位为+33至+34 mV，表明制剂稳定性良好。

CS-NPs对成纤维细胞的细胞毒性

MTT实验结果显示，CS-TV-NPs的IC₅₀值最高(20.31μg/mL)，表明其细胞毒性最低；CS-R-NPs和CS-C-NPs的IC₅₀值分别为1.42μg/mL和0.79μg/mL。计算选择性指数(SI)发现，CS-TV-NPs对光滑念珠菌和热带念珠菌的SI值分别为16.2和32.5，表明其具有较宽的治疗窗口。

体外药物释放曲线

药物释放研究表明，CS-TV-NPs在64小时内的累积释放率最高(60%)，而CS-R-NPs和CS-C-NPs分别为52.33%和53.33%。所有制剂均呈现时间依赖性释放模式，初始爆发释放后进入持续释放阶段。

封装药物的抗真菌活性

纳米封装显著增强了抗真菌效果。对于光滑念珠菌，CS-R-NPs、CS-C-NPs和CS-TV-NPs的MIC₅₀值分别为0.078、0.156和1.25μg/mL，远低于相应游离药物。对热带念珠菌也观察到类似趋势，纳米制剂的有效性比游离药物提高数十倍。

处理过的念珠菌分离株的基因表达分析

qRT-PCR分析显示，纳米制剂能显著下调耐药基因表达。在光滑念珠菌中，CS-NPs对SNQ2和ERG11基因的下调作用明显强于游离药物。在热带念珠菌中，CDR1和MDR1基因的表达也受到纳米制剂的强烈抑制，其中CS-R-NPs的效果最为显著。

研究结论表明，壳聚糖纳米粒作为药物递送系统，能显著增强利巴韦林、卡铂和百里香精油的抗真菌效果。其机制包括：提高药物溶解度稳定性、促进细胞内药物积累、破坏真菌细胞膜完整性以及下调耐药基因表达。特别是CS-TV-NPs展现出最优的综合性能，包括高封装效率、缓释特性、低细胞毒性和强大的基因下调能力。

该研究的创新点在于首次系统评估了负载RBV、卡铂和TV EO的壳聚糖纳米粒对氟康唑敏感和耐药念珠菌菌株的抑制作用，并从基因表达层面阐明了其克服耐药性的机制。这些发现为开发针对多重耐药念珠菌感染的新型纳米疗法奠定了重要基础，为解决临床抗真菌治疗难题提供了有前景的策略。