多花过江藤花精油GC-MS表征及其对耐药细菌生物被膜的抑制潜力

《Scientific Reports》：GC-MS characterization of bioactive compounds from Lippia multiflora Moldenke (Verbenaceae) flower essential oils and their antibiofilm potential against resistant bacteria

本研究针对细菌耐药性这一全球健康挑战，聚焦生物被膜（biofilm）形成的关键问题，开展了多花过江藤（Lippia multiflora）花精油的GC-MS表征及其抗菌/抗生物被膜活性研究。结果表明，该精油对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和变形链球菌（Streptococcus mutans）表现出优于标准抗生素的抑制活性（抑菌圈直径分别达28.38±0.23 mm和24.5±0.25 mm），最小抑菌浓度（MIC）均为0.10%，并能有效抑制生物被膜形成（抑制率分别为59.97±0.68%和71.63±0.15%）。其强效活性与富含β-石竹烯（43.55%）、吉玛烯D（16.44%）等萜类成分密切相关，为开发新型抗生物被膜天然制剂提供了有前景的先导化合物。

　　

在人类与病原微生物的漫长斗争中，抗生素的发现曾一度让我们占据上风。然而，道高一尺魔高一丈，细菌通过进化产生了耐药性，这已成为当今全球公共卫生领域的重大挑战。尤其令人头疼的是，细菌还有一种“抱团取暖”的生存策略——形成生物被膜（biofilm）。这好比细菌为自己建造了一个坚固的“堡垒”，它们聚集在一起，并分泌一种黏液状的基质将自己包裹起来。这个“堡垒”能显著阻碍抗生素的渗透，并保护内部的细菌免受宿主免疫系统的攻击，使得被生物被膜保护的细菌对抗生素的耐受性可比自由漂浮的（浮游）细菌高出上千倍。其中，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和变形链球菌（Streptococcus mutans）是两种典型的、与生物被膜相关的常见致病菌。前者可引起从皮肤感染到肺炎、心内膜炎等多种严重感染，后者则是导致牙菌斑和龋齿的主要元凶。因此，寻找能够有效破坏或抑制生物被膜形成的新型制剂，是克服细菌耐药性的一个关键研究方向。

在此背景下，天然产物，特别是植物精油，因其复杂的化学成分和多样的生物活性，成为了开发新型抗菌抗生物被膜剂的重要来源。多花过江藤（Lippia multiflora Moldenke）是一种在西非地区常被用作茶饮的芳香植物，其精油已被报道具有抗菌特性。然而，其花精油 specifically 针对耐药细菌生物被膜的抑制潜力尚不明确。为了填补这一研究空白，由Ablassé Rouamba领衔的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项研究，旨在系统地表征多花过江藤花精油的化学成分，并评估其对抗耐药金黄色葡萄球菌和变形链球菌的抗菌及抗生物被膜活性。

为了回答上述问题，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们首先从布基纳法索卢姆比拉地区采集了多花过江藤的野生花朵，通过水蒸气蒸馏法提取精油，并测定了其理化参数。随后，研究团队利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对精油的化学成分进行了详细鉴定。在生物活性评估方面，他们采用了琼脂扩散法测定抗菌活性，微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），结晶紫染色法通过酶标仪在590 nm波长下测定抗生物被膜活性，并通过DPPH自由基清除实验评估抗氧化能力。所有实验均设置了阳性对照（如标准抗生素、抗坏血酸、水杨酸）和阴性对照，并进行了三次独立重复以确保结果的可靠性。

Organoleptic characteristics and the physicochemical parameters of the essential oils

研究首先确定了精油的理化特性。精油呈淡黄色、清澈易流动的液体，具有薄荷-樟脑香气并带有草本香调。其在25°C下的相对密度为0.9449 ± 0.0009 g/mL，符合相关标准。

Anti-DPPH activity

抗氧化活性测试结果显示，多花过江藤花精油的DPPH半抑制浓度（IC₅₀）值为0.23 ± 0.02 μg/μL，显著优于阳性对照抗坏血酸（IC₅₀ = 0.33 ± 0.01 μg/μL），表明该精油具有非常强的自由基清除能力，提示其含有强效的抗氧化成分或成分间存在协同增效作用。

Antibiotic Susceptibility activity

抗菌敏感性试验结果令人印象深刻。精油对金黄色葡萄球菌和变形链球菌的抑菌圈直径分别达到28.38 ± 0.23 mm和24.50 ± 0.25 mm，显著大于所用标准抗生素（头孢噻肟和竹桃霉素）的抑菌圈，甚至对某些抗生素已不敏感的菌株也表现出强效抑制活性。

Determination of minimal inhibitory and minimal bactericidal concentrations

通过微量肉汤稀释法，研究人员确定该精油对两种测试菌株的最小抑菌浓度（MIC）均为0.10% (v/v)。然而，在测试范围内（≤ 0.10%），未能达到最小杀菌浓度（MBC），说明该浓度下的精油主要表现为抑菌作用而非杀菌作用。基于此，研究选择了亚抑制浓度（0.05%, 1/2 MIC）进行后续的抗生物被膜实验，以排除细菌生长抑制对结果的影响。

Antibiofilm activity

抗生物被膜实验是本研究的核心。结果显示，在0.05%的浓度下，多花过江藤花精油能有效抑制两种细菌的生物被膜形成。对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率为59.97 ± 0.68%，对变形链球菌的抑制率更高，达到71.63 ± 0.15%。该抑制效果显著优于阳性对照水杨酸（100 μg/mL），表明该精油在低于抑菌浓度的条件下仍能有效干扰细菌的群体行为和被膜形成。

Chemical analysis of the essential oils

GC-MS分析揭示了精油强大生物活性的物质基础。共鉴定出22种萜烯类及其衍生物，主要分为烃类单萜、含氧单萜、烃类倍半萜和含氧倍半萜四大类。其中四种成分含量尤为突出：β-石竹烯（β-caryophyllene, 43.55%）、吉玛烯D（germacrene D, 16.44%）、桉叶油醇（elemol, 10.33%）和桉树脑（eucalyptol, 6.41%）。这些化合物，特别是β-石竹烯，被认为是发挥抗菌和抗生物被膜活性的关键成分。

综上所述，本研究通过系统的化学和药理学分析，得出结论：多花过江藤花精油富含萜类化合物，特别是β-石竹烯，对其显著的抗氧化、抗菌和抗生物被膜活性起到了关键作用。该精油在体外对耐药的金黄色葡萄球菌和变形链球菌表现出优异的抗菌活性，尤其重要的是，其在亚抑菌浓度下能有效干扰生物被膜的形成，这一特性对于克服细菌耐药性具有重要意义。研究人员在讨论中提出了其潜在的作用机制，例如精油中的活性成分（如β-石竹烯）可能通过抑制变形链球菌的葡糖基转移酶（Gtf）或干扰金黄色葡萄球菌的表面粘附蛋白来阻碍生物被膜的早期形成和胞外聚合物（EPS）基质的合成。同时，其强大的抗氧化活性也可能通过调节细菌内的氧化还原状态或降解已形成的被膜基质来辅助抗生物被膜作用。当然，作者也指出了本研究的局限性，如仅限于体外实验，未进行时间-杀菌动力学、细胞毒性、具体分子机制（如对Gtf活性的直接测定）以及体内功效验证。尽管如此，这项研究首次全面揭示了多花过江藤花精油作为一种天然、多靶点制剂的巨大潜力，为后续开发基于植物精油的新型抗生物被膜策略，以应对日益严峻的抗生素耐药性危机，提供了坚实的科学依据和富有前景的先导化合物。