寡核苷酸RGLS4326的3'-末端鸟嘌呤介导脱靶AMPAR抑制及中枢神经毒性机制研究

《Nature Communications》：The nucleobase guanine at the 3’-terminus of oligonucleotide RGLS4326 drives off-target AMPAR inhibition and CNS toxicity

本研究针对第一代抗miR-17寡核苷酸RGLS4326在临床前研究中出现的中枢神经毒性问题，通过结构-活性关系分析发现其3'-末端鸟嘌呤可像适配体一样直接作用于AMPA受体，通过冷冻电镜解析了复合物结构，并成功开发出不含中枢神经毒性且保留靶向活性的新一代候选药物RGLS8429。

　　

在生物医药领域，寡核苷酸药物正成为治疗多种疾病的重要工具。目前已有17款RNA靶向寡核苷酸药物获得FDA批准。然而，这类药物的开发并非一帆风顺，许多候选药物因不可预见的脱靶毒性而在早期研发阶段折戟。RGLS4326作为第一代靶向miR-17家族的治疗常染色体显性多囊肾病的寡核苷酸，虽然在1b期临床试验中显示出令人鼓舞的药效学活性，但在非临床慢性毒性研究中观察到剂量限制性的中枢神经系统相关毒性，导致其开发被迫终止。

为了解开RGLS4326中枢神经毒性的谜团，研究人员开展了一项系统的结构-活性关系研究。令人惊讶的是，他们发现这种毒性并非来自对预期靶点miR-17的抑制，而是源于一种意想不到的"适配体样"直接相互作用——RGLS4326的3'-末端鸟嘌呤能够直接结合并抑制α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体。

研究表明，RGLS4326在重复皮下给药后能够穿过血脑屏障，在小鼠和猴子的脑组织中达到约1μg/g的浓度。通过靶点结合筛选，研究人员从174个分子靶点中鉴定出AMPAR是RGLS4326的主要脱靶靶点。全细胞膜片钳实验证实，RGLS4326是AMPAR的竞争性拮抗剂，其半数抑制浓度约为163nM，与毒性研究中观察到的脑暴露浓度高度吻合。

关键发现来自于对3'-末端核苷酸的精细分析。当研究人员将3'-末端的鸟嘌呤替换为腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶时，所有变体都显著降低了AMPAR抑制活性，同时保留了针对miR-17的抑制效力。其中，将鸟嘌呤替换为腺嘌呤得到的RGLS8429在保持药效的同时，完全消除了对AMPAR的脱靶作用和相关中枢神经毒性。

为了阐明分子机制，研究人员通过冷冻电镜解析了RGLS4326与AMPAR的复合物结构，分辨率达到3.13埃。结构显示，RGLS4326的3'-末端直接插入AMPAR的配体结合域，其中鸟嘌呤的第六位氢键受体与苏氨酸480直接相互作用，而嘧啶-咪唑环与酪氨酸732的芳香环形成π-π堆积作用。这种结合方式类似于竞争性拮抗剂，稳定了配体结合域的开放构象，导致离子通道关闭。

研究人员开展的关键技术方法包括：通过放射性配体结合实验和全细胞膜片钳技术评估脱靶效应；利用冷冻电镜解析蛋白质-寡核苷酸复合物结构；通过慢性毒性研究评估中枢神经系统安全性；采用药代动力学和药效学分析比较候选药物特性；使用常染色体显性多囊肾病小鼠模型验证治疗效果。研究涉及的样本包括CD-1小鼠、食蟹猴和Pkd1^F/RC转基因小鼠。

CNS毒性在RGLS4326治疗后的非临床毒性研究中的表现

在RGLS4326的慢性毒性研究中，小鼠在每周皮下注射100和450mg/kg剂量后出现异常步态、侧卧、共济失调和嗜睡等中枢神经毒性症状。研究显示，这些症状在给药后4-8小时开始出现，通常在24小时内消退，呈现急性特征。免疫组化分析证实RGLS4326可在脉络丛区域检测到，在海马和皮层区域有微弱染色。

RGLS4326抑制AMPAR配体结合和功能

RGLS4326在100μM浓度下可抑制37个靶点的配体结合超过75%，其中对AMPAR的半数抑制浓度低于10μM。功能实验表明，RGLS4326是AMPAR的竞争性拮抗剂，在0.3μM浓度下即可抑制50%的受体活性，这一浓度与毒性研究中观察到的脑暴露浓度相符。

RGLS4326的3'-末端鸟嘌呤驱动脱靶AMPAR抑制

通过构建包含约30个抗miR-17寡核苷酸的文库，研究人员发现3'-末端鸟嘌呤的存在是AMPAR抑制的关键决定因素。含有3'-末端鸟嘌呤的寡核苷酸均表现出显著的AMPAR抑制活性，而其他核苷酸的替换则大大降低了这种抑制作用。

新一代抗miR-17药物RGLS8429的发现

将RGLS4326的3'-末端鸟嘌呤替换为腺嘌呤得到的RGLS8429，在保持对miR-17家族抑制活性的同时，显著降低了对AMPAR的抑制作用。在毒性研究中，RGLS8429即使在高剂量下也未观察到中枢神经毒性。

RGLS8429保留RGLS4326的所有有利特性

RGLS8429与RGLS4326具有相似的药代动力学特征，均优先分布至肾脏，药效学特征也高度一致。在Pkd1^F/RCADPKD小鼠模型中，两者均能相似地抑制囊肿生长。

CNS毒性并非由on-target miR-17抑制引起

脑室内注射实验进一步证实，RGLS4326的中枢神经毒性源于AMPAR抑制而非miR-17抑制，因为能够抑制miR-17但不影响AMPAR的RG8431即使在较高剂量下也表现良好耐受性。

RGLS4326结合的AMPAR复合物的冷冻电镜结构

冷冻电镜结构显示，RGLS4326的3'-末端插入每个配体结合域的蛤壳结构中，5'-末端向外突出。3'-末端鸟嘌呤精确位于天然配体谷氨酸的结合位点，与相同的残基发生相互作用。

AMPAR被RGLS4326抑制的结构基础

RGLS4326的结合导致配体结合域打开约31度，这是迄今观察到的最大程度蛤壳打开。这种构象变化导致离子通道紧闭，从而抑制受体功能。

本研究不仅阐明了一种意外的寡核苷酸脱毒性机制，而且展示了如何通过合理的药物设计消除脱靶效应。更重要的是，这项工作为寡核苷酸药物的安全评估提供了重要见解，表明类似于小分子药物的次级药理学筛选策略在评估寡核苷酸的脱靶效应方面具有重要价值。研究人员成功地将RGLS4326转化为RGLS8429（现称为farabursen），在消除中枢神经毒性的同时保留了所有治疗优势，为常染色体显性多囊肾病的治疗带来了新的希望。

该研究的成功表明，深入理解寡核苷酸的结构-活性关系对于开发安全有效的治疗药物至关重要。通过细致的机制研究和合理的药物设计，可以成功解决寡核苷酸药物开发过程中遇到的脱靶毒性问题，为未来寡核苷酸药物的开发提供了重要借鉴。

值得注意的是，这项研究不仅解决了一个具体的药物开发问题，而且为寡核苷酸药物与蛋白质的意外相互作用提供了新的见解。研究发现，短链寡核苷酸可能表现出类似适配体的特性，直接与特定蛋白质靶点结合，这一发现可能为未来设计靶向特定蛋白质的寡核苷酸 therapeutics 开辟新的可能性。

研究还提示，寡核苷酸药物的长度和序列特征可能影响其血脑屏障穿透能力，这为设计中枢神经系统靶向的寡核苷酸药物提供了新思路。同时，这项工作也展示了结构生物学在理解药物脱靶机制中的强大能力，冷冻电镜技术的应用为阐明分子水平的相互作用机制提供了关键证据。