祖先分子伴侣蛋白首次揭示早期多聚体蛋白进化结构奥秘

《Molecular Biology and Evolution》：Ancestral Chaperonins Provide the First Structural Glimpse into Early Multimeric Protein Evolution

本研究通过祖先序列重建（ASR）和蛋白质复活技术，成功复活了三个 chaperonin（Hsp60 伴侣蛋白）家族（Group I-III）的最后共同祖先（ACI、ACII、ACIII），并利用冷冻电镜（Cryo-EM）首次揭示了其独特的寡聚化结构。研究发现 ACI 形成单七元环，ACII 呈现单/双八元环混合态，ACIII 则形成双八元环，这为理解从单环到双环的渐进式进化提供了直接证据。ACII 还展现出独立于辅助伴侣蛋白的腔体闭合机制。这些发现不仅揭示了 chaperonin 早期结构多样性的起源，也为探索早期生命在极端环境下的蛋白质折叠机制提供了关键见解。

　　

蛋白质是生命的基石，其正确折叠对细胞功能至关重要。然而，蛋白质在合成或应激条件下容易发生错误折叠和聚集，进而引发细胞功能紊乱甚至疾病。在这一过程中，一类被称为分子伴侣（molecular chaperones）的蛋白质扮演着“折叠助手”的角色。其中， chaperonins（又称 Hsp60 伴侣蛋白）是一类在所有生命领域中都存在的、大型的桶状复合物，它们作为分子机器，为新合成的蛋白质提供受保护的环境，使其能够高效折叠，这是蛋白质稳态（protein homeostasis）的一个关键方面。除了折叠功能， chaperonins 还能通过防止聚集和协助错误折叠的蛋白质重新折叠来防御应激（如温度波动、氧化应激或化学暴露）。

chaperonins 可能从硫氧还蛋白（thioredoxin）超家族中的一个多功能祖先演化而来，具体来说，是一个具有抗氧化和伴侣蛋白活性的过氧化物氧化还原蛋白样蛋白（peroxiredoxin-like protein）。这种双重功能在现代含有硫氧还蛋白结构域的 chaperedoxins（它们在体内与 GroEL 结合）和过氧化物氧化还原蛋白中仍然存在，突出了它们在保护蛋白质和 DNA 免受氧化和热应激方面的作用。这种进化起源表明，极端环境压力（如高温、酸性、多变的盐度）塑造了早期的 chaperonins。 chaperonins 和硫氧还蛋白在细菌基因组中的广泛存在和持久性，通常处于正选择之下，强调了它们的进化重要性和适应性。

尽管 chaperonin 单体共享一个共同的三结构域结构（顶端结构域参与底物识别，赤道结构域包含 ATP 结合位点，中间结构域通过传递信号连接两者），但它们根据其独特的结构和系统发育关系分为三个不同的组（Group I-III）。Group I chaperonins 发现于细菌和真核生物的细胞器（如线粒体和叶绿体）中，以大肠杆菌（Escherichia coli）中深入研究的 GroEL/GroES 系统为代表。Group II chaperonins 存在于古菌和真核生物的细胞质中（如古菌中的 thermosome 和真核生物中的 CCT/TRiC 复合物），具有一个内置的“盖子”机制，无需单独的辅助伴侣蛋白。Group III chaperonins 发现于一些细菌中，与 Group II 相似但缺乏 Group I 和 II 中存在的核苷酸感应环（nucleotide-sensing loop），该环通过构象变化调节 chaperonin 环的打开和关闭，并促进 ATP 水解信号在亚基间的传递。这些组之间的结构差异暗示了不同的进化路径，但它们通过同源性和功能相关联。

这些组之间的进化关系仍未解决。一些研究人员提出，Group III chaperonins 代表了一种古老的形式，Group I 和 II 起源于此，GroES 可能源于 Group III chaperonin 盖子区域的切除。另一些人则认为 Group III chaperonins 出现较晚，可能是通过基因水平转移从古菌祖先转移到厚壁菌门（Firmicutes）细菌中。这些相互竞争的假设突出了 chaperonin 进化的复杂性以及需要新方法来解开其历史。

祖先序列重建（Ancestral Sequence Reconstruction, ASR）是解决这些问题的有力工具。通过推断古代 chaperonins 的序列，然后在实验室中“复活”它们，我们可以深入了解早期生命中这些分子机器的结构和功能特性。ASR 随后进行蛋白质生产，也称为“蛋白质复活”，已成功应用于其他古代蛋白质，揭示了诸如日益增加的混杂性、更大的构象多样性、更高的热稳定性和改善的异源表达等趋势。

在这项发表于《Molecular Biology and Evolution》的研究中，研究人员应用 ASR 技术来探索 chaperonins 的进化起源和结构多样化。通过重建祖先 chaperonin（AC）序列并检查它们的寡聚结构，他们旨在回答关键问题：哪一组 chaperonins 最先进化？Group I、II 和 III 之间的结构差异是如何在进化时间中出现的？除了阐明 chaperonin 的进化，这些发现有望为研究早期细胞生命中多聚体复杂性的出现提供直接的实证框架，并可能对理解生命在地球及其他行星极端环境下的适应性提供启示。

为了开展研究，研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：首先，利用祖先序列重建（ASR）技术，基于968个代表性原核 chaperonin 序列重建系统发育树，并推断关键祖先节点（ACI, ACII, ACIII, AFCB）的序列。其次，通过基因合成、克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达这些祖先蛋白，并利用镍柱亲和层析和尺寸排阻色谱进行纯化。第三，运用透射电子显微镜和冷冻电镜（Cryo-EM）对纯化的蛋白复合物进行结构解析，包括二维分类和三维重构，获得了高分辨率结构。第四，通过BIOMOL GREEN?试剂法测定ATPase活性，并利用乳酸脱氢酶（LDH）热失活保护实验评估其分子伴侣功能。第五，采用计算工具（如APBS分析静电势，FoldX预测折叠能量变化）对祖先蛋白的理化性质进行深入分析。

重建与表征祖先 chaperonins

为了更好理解 chaperonins 的进化史，研究人员利用968个代表性原核 chaperonin 序列重建了其系统发育历史。他们选择了几个AC节点进行蛋白质合成和纯化，包括Group I（ACI）、Group II（ACII）和Group III（ACIII）的最后共同祖先，以及Fibrobacteres-Chlorobi-Bacteroidetes（FCB）群的祖先（AFCB）。预测的祖先 chaperonin 序列与现代同源物相比具有60%到81%的序列同一性。研究人员将编码这四个祖先序列的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，表达并纯化了重组蛋白。通过透射电子显微镜研究其组装情况，发现ACI在ATP-Mg²⁺存在下形成7亚基单环寡聚体；ACII即使没有ATP也形成8亚基寡聚体的异质混合物，包括单环和双环，ATP-Mg²⁺的加入促进了ACII的寡聚化，增加了整体环的形成，但并未显著改变单双环的比例；ACIII在没有ATP-Mg²⁺的情况下组装成8亚基双环；AFCB形成7亚基双环。

通过冷冻电镜对祖先 chaperonins 进行结构表征

为了研究新蛋白的结构细节，研究人员利用冷冻电镜确定了它们的高分辨率3D结构。对四个AC的颗粒进行2D分类显示，ACI和AFCB形成七元环，而ACII和ACIII组装成八元环，这反映了它们的现代对应物。关于其整体结构，ACIII和AFCB观察到了典型的 chaperonin 双环结构。相比之下，ACI显示出单环结构，ACII则显示出双环（主要）和单环的混合物。

对ACI的详细3D分析证实其组装成稳定的单七元环。其“开放状态”结构的分辨率可能受到 chaperonin 固有结构灵活性的限制，特别是在顶端结构域。尽管这些区域通常更难解析，但顶端结构域增加的动态性可能在Group I chaperonins 的早期进化中至关重要。为了进一步研究ACI单环结构，研究人员将其序列和结构与特征明确的大肠杆菌单环突变体（SR1）进行了比较。在ACI中，存在三个功能类似的氨基酸取代，它们也位于环-环界面，可能干扰双环形成所需的亚基间相互作用。祖先序列重建显示这四个残基具有较高的后验概率，并且它们的进化轨迹突出了动态变化。

对于ACII，研究人员成功解析了其开放和闭合状态下的单环和双环结构。只有最丰富的寡聚状态——闭合双环结构（占所有颗粒的35%）——产生了足以进行原子建模的图谱。将该结构与现代 chaperonins（如大肠杆菌GroEL或真核 chaperonin CCT）比较时，发现ACII拥有一个类似于CCT的盖子突起。这一特征使得ACII无需像GroEL那样需要单独的辅助伴侣蛋白如GroES即可闭合其空腔。这一结构元素表明ACII发展出了一种不依赖于GroES样辅助伴侣蛋白的空腔闭合早期机制。一个有趣的观察是，ACII的闭合构象不如CCT的闭合构象锁定得紧密，表明两种 chaperonin 之间存在不同的闭合机制。通过分析ACII和CCT亚基内顶端、中间和赤道结构域观察到的结构变化，并计算均方根偏差（RSMD），研究人员发现主要变化发生在顶端区域的排列上，包括中间结构域。对亚基内相互作用的进一步检查突出了几个值得注意的方面。在CCT中，接触亚基表现出有些不同的相互作用，例如盐桥和氢键的形成。在ACII中，存在类似的盐桥，但由于顶端区域顶端缺乏相互作用，导致其闭合不如CCT亚基那样完全。

在ACIII的情况下，在没有ATP的情况下即可观察到寡聚结构，并且它们都形成双环结构。获得的结构类似于现代 thermosomes，尽管在顶端结构域观察到的灵活性阻止了研究人员对这些区域进行建模。

对于AFCB，其结构与现代Group I chaperonins 非常相似。将AFCB的序列与参与GroEL-GroES相互作用的三个关键残基进行比较表明，所有三个必需残基在AFCB中都是保守的，这强烈表明AFCB很可能与GroES型辅助伴侣蛋白相互作用，暗示了 chaperonin 与其辅助伴侣蛋白对应物在FCB谱系内的共同进化。

祖先 chaperonins 的功能评估

研究人员接下来将ACs的活性与现代大肠杆菌（Group I）和Carboxydothermus hydrogenoformans（Group III）的 chaperonin 在相同条件下表达的蛋白进行了比较。使用BIOMOL GREEN?试剂监测了从30℃到60℃以10℃为增量的ATPase活性。来自嗜热菌C. hydrogenoformans 的Group III chaperonin 显示出最高的ATP水解速率，其次是AFCB。其余 chaperonins（大肠杆菌GroEL、ACI和ACIII）表现出相似的水解模式。C. hydrogenoformans 的ATPase水解在60℃达到峰值，而其他则在50℃达到峰值。未检测到ACII的ATP水解活性。C. hydrogenoformans 和大肠杆菌的ATPase活性与之前的报道一致。

为了评估 chaperonin 功能，研究人员评估了它们保护乳酸脱氢酶（LDH）免受热诱导失活的能力。当在48℃孵育时，LDH在15分钟内失去50%的活性，在35分钟内几乎失去所有活性。然而，在祖先或现代 chaperonins 存在下，LDH活性得以保留。现代C. hydrogenoformans chaperonin 在5分钟后最初增强了LDH活性，随后在15分钟时恢复到基线水平，并在35分钟时略微下降至初始活性的75%。AFCB和ACIII显示出相似的模式，LDH活性有小幅初始增加，然后在35分钟后稳定在约75%的活性。相比之下，ACI和ACII提供了持续的保护：在整个实验过程中，ACII存在下LDH活性保持在约150%，而ACI在最初5分钟内导致活性增加2.5倍，然后在孵育结束时恢复到基线水平。

静电势和折叠能量的进化趋势

为了进一步表征ACs并识别潜在特征，研究人员使用APBS方法分析了它们的静电特性，并利用FoldX计算了折叠能量的变化。静电势图计算显示，最古老的重建祖先（ACI和ACII）主要表现出负的表面静电势。

自由折叠能量的计算分析揭示了祖先性（ancestrality）与关键结构参数（氢键、熵、静电相互作用、溶剂化效应、范德华相互作用和扭转能）之间的显著相关性，所有这些都有助于蛋白质稳定性。Group I祖先与主链氢键、侧链氢键和电离能呈显著正相关（≥0.5）；与主链熵和扭转能呈显著负相关（≤-0.5）。Group II祖先与主链氢键、侧链氢键和电荷-电荷相互作用呈显著正相关；与侧链熵、主链熵和电离能呈显著负相关。Group III祖先与总稳定性、范德华相互作用、非极性溶剂化和扭转能呈显著正相关；与极性溶剂化、主链范德华冲突和螺旋偶极效应呈显著负相关。这些分歧表明不同的 chaperonin 谱系发展了专门的策略，利用不同的物理化学机制来优化蛋白质稳定性。

讨论

祖先 chaperonins 中的中间单环结构支持逐步寡聚化模型

研究人员基于96个现代序列的系统发育分析产生了与先前研究一致的拓扑结构，并使他们能够复活和表征四个祖先节点（ACI, ACII, ACIII, AFCB）。他们观察到最早的祖先——ACI（细菌GroEL）和ACII（古菌 thermosome）——是单环结构。在Group I系统中，已知双环结构在ATP水解时会解离，从而增加对较大底物的折叠能力，并且已在噬菌体编码的 chaperonins、人线粒体 chaperonin 和细菌GroEL/ES系统中观察到单环结构。据研究人员所知，ACII代表了首个报道的Group II chaperonin 单环结构。

从ACI的完全单环结构，到ACII中单环和双环的混合，最后到ACIII的完全双环组装的进化进程，表明从单环到双环 chaperonins 是逐步的、一步一步的进化。这种模式支持了一个时间线，即ACI是最古老的祖先，其次是ACII，然后是ACIII——后者很可能是通过古菌祖先和厚壁菌门细菌之间的基因水平转移产生的。序列分歧模式也证实了这一时间线，显示ACI分歧最大，其次是ACII，然后是ACIII和AFCB。

在结构上，ACII具有一个独特的构建螺旋突起，充当盖子，消除了对GroES型辅助伴侣蛋白用于空腔闭合的需求。这一特征可能反映了现代Group I和II chaperonins 结构之间的中间进化阶段。另一个关键区别在于它们的亚基结构：ACI有七个亚基而ACII有八个——这种化学计量比反映了它们的现代对应物。这些差异可能源于LUCA中存在多种组装类型，或者反映了进化过程中环大小的谱系特异性变化。

在功能上， chaperonins 通过两种主要的构象状态运作：用于底物识别的开放状态，以及用于捕获和促进蛋白质折叠的闭合状态。ACs似乎发展出了两种不同的空腔闭合机制。细菌 chaperonins 与一个小型封盖寡聚体（辅助伴侣蛋白）共同进化，而古菌和真核 chaperonins 则发展出了一个额外的序列，一个履行相同锁定作用的盖子状突起。这些功能变异表明 chaperonins 保守的折叠腔适应了不同的功能和环境压力。

蛋白质复杂性（从更简单到结构和功能更精细的蛋白质，例如从单体到寡聚体或通过获得额外结构域）的进化已在先前的工作中使用ASR进行了探索。特别是，多聚化已在ATPase复合物和RuBisCO蛋白家族中进行了研究。Thornton 及其同事已经表明，这种转变可以通过一个或几个突变自然发生。基于这项工作，本研究揭示了 chaperonin 家族内的进化轨迹。研究人员发现ACI可能在单体和单环状态之间转换，代表了寡聚化的早期阶段。相比之下，ACII和ACIII主要形成稳定的双环组装，表明完全的寡聚复杂性分子框架在这些类群中已经建立。ACII中单环和双环组装的共存说明了一个进化中间体，其中寡聚化的分子架构已经出现但尚未完全优化——可能缺乏一个或几个关键突变来显著增强结合亲和力并稳定双环状态。虽然研究人员没有明确测试分子复杂性进化的机制模型，但对已知破坏双环组装的氨基酸（R452E, E461A, S463A, V464A）在后验概率的分析显示，祖先序列（ACI）以高置信度保留了这三个取代。追踪这些概率跨节点的变化揭示了动态转变：在ACI中可能阻止双环形成的残基逐渐让位于有利于双环形成的取代，特别是在环-环界面。总之，这些模式进一步支持了早期Group I chaperonins 从单环结构到双环结构的逐步进化转变。

祖先 chaperonins 表现出不同的功能特征

在中性条件下，所有测试的祖先 chaperonins 都检测到了ATPase活性，除了ACII。ACII中未检测到活性可能表明需要特定的辅因子，例如在某些产甲烷古菌和细菌 thermosome 样系统中观察到的铵盐。尽管ACII缺乏可检测的ATPase活性，但它在保护LDH免受热失活方面非常有效。事实上，它在48℃下维持LDH稳定性方面优于其他 chaperonins，在整个实验过程中维持了150%的活性。虽然研究人员最初尝试评估这些ACs协助化学变性蛋白质复性的能力，但技术挑战阻止了这些实验的进行。具体来说，即使使用大肠杆菌GroEL作为对照，他们也未能检测到成功的重折叠，这可能是由于其实验设置中缺乏其必需的辅助伴侣蛋白GroES。因此，他们将重点转向了一个更有限但仍有启发性的保护性实验（LDH热失活），这为了解ACs的应激反应能力提供了有价值的见解。

尽管重建序列最接近的现代序列（在NCBI nr数据库中）来自嗜热生物，但祖先蛋白的活性与来自大肠杆菌的中温菌GroEL相当。这与其他通过ASR重建的蛋白质常常表现出高热稳定性形成对比。这表明ACs可能是一个独特的案例，其中极端的热稳定性不是其定义的祖先特征或功能要求。然而，关于ATP依赖的稳定性和活性的结果并不一定排除热适应性。一些现代嗜热 chaperonins 也表现出ATP依赖的寡聚化，并且ATPase活性 alone 可能不能完全反映热稳健性。

预测的静电特征暗示了古代环境压力

蛋白质表面的静电势对于分子相互作用至关重要，该电势的变化可以指示蛋白质如何适应环境压力。分析显示，ACI和ACII（可能最早的祖先蛋白）具有高度负的表面电荷。这表明Group I和II中的ACs在负表面电荷有利的条件下进化。例如，这些变化可能有助于在酸性或高盐条件下稳定蛋白质，或增加高温下的热稳定性。有趣的是，与ACI序列同一性最高的现代同源物是一种嗜酸嗜热菌，这呼应了祖先硫氧还蛋白对酸性环境的适应。考虑到提出的 chaperonins 和硫氧还蛋白之间的进化联系，这种平行性支持了这两个家族可能都起源于严酷的原始环境的观点，在那里静电表面特性对蛋白质稳定性至关重要。具体来说，正表面电荷可能有助于在低pH条件下防止质子驱动的去稳定化，而表面电荷可能对于在高盐度栖息地维持溶解度和防止聚集至关重要。随着环境条件在进化时间中波动，增加的正电荷可能被选择性青睐以平衡蛋白质的稳定性和功能，突出了它们的适应多功能性。虽然静电分布和现代同源物表明ACs可能适应了高温、低pH或高盐度环境，但这些假设仍然是推测性的。研究人员没有在极端条件下实验测试活性，因此缺乏直接证据。

能量变化的趋势揭示了不同的进化路径

能量变化的趋势揭示了三个 chaperonin 组之间不同的进化路径，这是由环境压力驱动的。在Group I和II中，整体稳定性保持相对恒定。然而，研究人员观察到氢键显著增加，熵项（由FoldX计算，包含主链和侧链构象熵）减少。这表明这些组中的ACs可能进化出更有序和更刚性的结构，以在压力下维持稳定性。这种模式与在嗜热蛋白质中的观察一致，它们通过更强的分子内力而非整体稳定性的显著变化来增强稳定性。在Group II中，推断的电荷-电荷相互作用的增加和电离能的减少指向了对高盐环境的适应，在那里平衡静电相互作用对于溶解度和功能至关重要。类似的适应在嗜盐蛋白质中发现，它们优化表面电荷以防止在盐水条件下聚集。相反，Group I中电离能的增加表明了对酸性环境的适应，在那里稳定带电残基对于维持结构完整性至关重要——这是嗜酸蛋白质的共同特征。对于Group III祖先，总稳定性的显著增加似乎是由增强的范德华力和减少的主链冲突驱动的，表明疏水堆积增强。这是在嗜热蛋白质中有充分记载的适应，其中紧凑的疏水核心提供了对高温的弹性。此外，极性溶剂化的减少和非极性溶剂化的增加表明亲水性降低。这可能反映了对低水活性环境的适应，例如高盐、酸性或嗜热栖息地。总之，这些趋势表明环境压力是塑造 chaperonins 进化的一个重要因素，驱动了对极端条件的结构适应。这支持了早期 chaperonins 很可能在类似于早期地球存在的嗜卤酸性、可能嗜热的环境中进化的假设。这与先前对祖先核苷酸二磷酸激酶和核糖体蛋白uS8s的分析（提出了原始的碱性栖息地）形成对比。然而，这些情景并不相互排斥，塑造一个蛋白质家族的选择压力可能不同于作用于另一个的压力。尽管如此，先前和最近的预生物化学进展支持生命可能在酸性热液环境中形成的观点。对祖先硫氧还蛋白的研究强化了这一观念，增加了早期生命在炎热、酸性条件下繁盛的观点。这些仍然是开放性问题，有待进一步研究。

结论

这项研究表明，ASR尽管存在固有挑战及其自身实施的实践限制，但可以揭示ACs中意想不到的结构特征。研究结果支持了一个模型，即 chaperonins 从单环组装逐渐进化，ACII可能代表了一个进化中间体。这些结构变化，加上ATP依赖性和稳定性的转变，表明了一个朝向更大分子复杂性的总体趋势。尽管描述的能量模式是通过计算推断的，并且依赖于结构模型而非直接测量——因此需要谨慎解释——但它们确实表明了对酸性、高盐环境的适应。这些环境压力可能塑造了早期蛋白质进化。虽然其中一些见解仍有待实验验证，但它们与其密切相关的硫氧还蛋白家族的发现一致。总体而言，这项工作为复杂性如何在分子系统中出现提供了越来越多的证据。它也突出了进化模式，可以指导未来对早期细胞生命关键转变和现代蛋白质架构（特别是在 chaperonin 家族内）发展的研究。