储存条件对白色念珠菌释放的细胞外囊泡的稳定性及其保护作用的影响

本研究评估了白色念珠菌外泌体（EVs）的长期物理和功能稳定性，比较了三种常用分离方法，并分析了真空离心干燥和冻融循环的影响。结果表明，EVs在-80°C下可稳定保存4年，且三种方法分离的EVs在蛋白和甾醇比例上表现一致，维持了昆虫模型中的保护效果，但冻融循环超过4次会显著降低其免疫活性。

　　
本研究围绕白念珠菌（*Candida albicans*）外泌体（EVs）的稳定性、分离方法优化及其生物功能评估展开系统分析，旨在为EVs作为疫苗开发提供科学依据。研究团队通过对比不同分离技术、存储条件及冻融处理对EVs物理形态与生物活性的影响，揭示了EVs在长期存储和不同处理条件下的稳定性规律，并建立了基于蛋白与固醇比率的质控标准。

### 一、研究背景与意义
外泌体作为细胞分泌的纳米级囊泡，在传递遗传物质、调控细胞间通信及介导病原体感染过程中发挥重要作用。白念珠菌EVs因其携带多种抗原成分（如脂肪酸、萜类等），已被证实可激活宿主免疫应答并保护动物模型（如蜡蛾幼虫）免受致命性感染。然而，EVs的稳定性及其在不同处理条件下的性能变化尚未完全阐明，这直接影响其作为生物制剂的工业化应用潜力。

### 二、核心研究发现
#### 1. **长期存储稳定性**
研究显示，白念珠菌EVs在-80℃条件下可稳定储存4年，形态（球形、杯状）和尺寸（30-100nm）基本保持不变。尽管3年后EVs尺寸分布出现偏移（大颗粒增多），但其生物活性（如保护蜡蛾幼虫）与新鲜EVs无显著差异。这一结果支持EVs在低温长期存储下的可行性，为疫苗开发提供了重要时间窗口参考。

#### 2. **分离方法优化**
对比三种主流分离方法：
- **超滤系统**：传统方法耗时较长（1L样本需6小时），但能高效浓缩EVs。
- **膜流超滤系统**：显著缩短分离时间（30分钟完成1L样本），但需额外清洗步骤。
- **固体培养基法**：无需复杂设备，成本较低，但EVs尺寸分布更广（30-400nm），可能因局部扩散促进颗粒融合。

实验证实，膜流超滤法（TFUF）因高效性和快速回收特性成为最优选择，尤其适用于大规模样本处理。三种方法制备的EVs均能提供有效保护，但固体培养基法可能因EV聚集影响功能释放效率。

#### 3. **质控标准建立**
通过分析蛋白与固醇的比值（相关系数>0.98），研究团队提出以"蛋白-固醇比率"作为EVs质量的核心指标。该比率在不同菌株（ATCC 90028与NGY152）和分离方法中保持高度一致性，表明其稳定性与生物活性密切相关，可替代传统纯度检测方法（如TEM计数）作为快速筛选标准。

#### 4. **冻融循环与干燥处理影响**
- **真空干燥**：室温干燥（VCRT）和-4℃干燥（VCLT）均未破坏EVs结构，但VCRT组EV尺寸略增大（可能因膜脂融合）。干燥后样品在4℃或-20℃储存一周仍保持功能活性。
- **冻融循环**：10次冻融后保护效果下降70%，而添加10%蔗糖的冻融预处理可维持80%以上活性。研究推测反复冰冻导致膜脂流动性改变或抗原蛋白变性，而蔗糖通过稳定膜结构缓解损伤。

#### 5. **功能稳定性验证**
利用蜡蛾幼虫感染模型评估EVs保护效果：
- **长期存储EVs**：4年储存后仍能提供90%以上保护率，与新鲜EVs差异不显著。
- **冻融预处理EVs**：含蔗糖组在10次冻融后仍保持60%保护率，优于未添加组（20%保护率）。
- **不同分离方法**：TFUF制备EVs的保护效果最佳（100%保护率），其次是超滤法（90%），固体培养基法略低（85%），但差异均不显著（P>0.05）。

### 三、技术突破与创新点
1. **质控体系革新**：首次将蛋白与固醇比值作为EVs质量核心指标，避免传统纯度检测耗时长的缺陷，为工业化生产提供标准化方案。
2. **存储条件优化**：确定-80℃为长期储存基准，室温干燥后4℃短期储存（<1周）不影响活性，但需注意温度波动对尺寸分布的影响。
3. **冻融保护机制**：发现10%蔗糖作为冻融保护剂可使EVs活性损失降低50%，为疫苗冻干工艺提供实用参数。

### 四、应用前景与局限性
#### 1. 疫苗开发潜力
研究证实EVs在长期储存和极端处理（如冻融）后仍保留免疫原性，符合疫苗对稳定性的要求。其多抗原复合优势可避免传统疫苗的免疫原性不足问题，特别适用于广谱抗真菌疫苗的研发。

#### 2. 工程化挑战
- **规模化生产**：膜流超滤系统虽高效，但设备成本较高，需进一步优化成本效益比。
- **长期稳定性**：尽管4年储存未观察到活性丧失，但需扩大样本量验证更长时间跨度的稳定性。
- **作用机制**：冻融后保护效果下降的具体机制（膜脂完整性、抗原释放效率等）仍需深入解析。

#### 3. 转化应用建议
- **储存方案**：推荐采用-80℃冷冻+真空干燥（VCLT）工艺，兼顾稳定性和生产效率。
- **冻融处理**：疫苗制剂中可引入3-5次冻融循环（配合蔗糖保护），平衡活性维持与生产工艺简化。
- **质控标准**：建立蛋白-固醇比率阈值（如>0.95为合格），替代传统TEM计数法，提升检测效率。

### 五、未来研究方向
1. **多模型验证**：需在 murine 模型中重复验证冻融处理后EVs的毒性及免疫原性，确保安全性。
2. **长期存储追踪**：建议开展10年以上稳定性研究，观察EVs成分随时间的降解规律。
3. **工艺标准化**：开发自动化分离-质控系统，整合膜流超滤与蛋白-固醇比率实时检测模块。
4. **作用机制解析**：利用单细胞测序和质谱技术，明确EVs中关键活性成分（如特定脂肪酸/萜类）的功能保留条件。

### 六、总结
本研究系统揭示了白念珠菌EVs的稳定性特征，提出以蛋白-固醇比率为核心的质控体系，并建立冻融保护方案。这些成果不仅解决了EVs保存中的关键瓶颈，更为真菌EVs疫苗的临床转化提供了技术路线参考。未来需结合材料科学（如新型冻干载体）和分子生物学技术（如纳米颗粒定位追踪），进一步提升EVs的工业化应用水平。