对疑似呼吸道霉菌感染的癌症患者进行分子诊断

一项多中心前瞻性研究比较了支气管肺泡灌洗液（BALF）中真菌检测方法，发现特定qPCR对曲霉和毛霉的检测最敏感（曲霉26% vs FISH 15% vs 培养8%），血清检测敏感性较低。FISH可预测后续培养阳性，但存在假阳性风险。研究强调BALF qPCR在侵袭性真菌感染诊断中的重要性，并指出需优化DNA提取方法以提高检测准确性。

　　
### 研究背景与目的
侵袭性真菌感染（IFIs）是癌症患者的重要并发症，尤其是曲霉病和毛霉菌病。早期准确识别病原体对制定针对性抗真菌治疗至关重要。然而，传统检测方法（如培养和显微镜检查）灵敏度不足，且存在耗时长、易漏检等问题。本研究旨在比较几种分子检测方法（特异性qPCR、泛真菌qPCR及荧光原位杂交，FISH）与培养法在 BALF（支气管肺泡灌洗液）和血清中的诊断效能，以优化临床检测策略。

### 研究设计与样本
该研究为多中心前瞻性队列研究，纳入2016-2018年间222名患者的234例疑似真菌肺炎病例。样本类型包括BALF（占比210例）和血清（175例）。通过回顾性分析临床数据、影像学特征及实验室检测结果，将病例分为确定（3例）、可能（107例）、可疑（72例）及未分类（28例）四类。主要排除标准为未提交样本或临床数据缺失。

### 关键检测方法
1. **培养法**：通过不同培养基（如Sabouraud-Dextrose琼脂、抑制性霉菌琼脂）分离真菌，但培养阳性率较低（Aspergillus 7%、Mucorales 1%）。
2. **泛真菌qPCR**：初期尝试检测所有真菌DNA，但因频繁检测到定植酵母菌（如念珠菌）导致假阳性率高，研究中途终止该实验。
3. **特异性qPCR**：针对曲霉（Aspergillus）和毛霉菌（Mucorales）设计探针，结果显示曲霉特异性qPCR灵敏度达47%（75例确诊/可疑病例中35例阳性），显著高于培养法（23%）和FISH（15%）。
4. **FISH技术**：通过荧光探针靶向真菌rRNA，发现FISH能清晰识别曲霉分生孢子（26例）和毛霉菌结构（6例），且与后续培养结果具有预测价值（如FISH阳性者中63%最终确诊为曲霉或毛霉菌感染）。
5. **血清检测**：qPCR检测血清中真菌DNA，但阳性率较低（曲霉9%、毛霉菌5%），且易遗漏毛霉菌感染（血清阳性仅占检测病例的8%）。

### 核心发现
1. **检测方法对比**：
- **特异性qPCR**在检测曲霉和毛霉菌方面表现最佳，阳性率分别为47%和9%。
- **FISH技术**虽灵敏度低于qPCR（15% vs 47%），但可直观显示真菌结构（如分生孢子），且与后续培养结果高度相关（FISH阳性病例中82%最终确诊）。
- **培养法**灵敏度最低（曲霉7%、毛霉菌1%），可能与样本处理延迟或选择性培养基不足有关。

2. **病原体分布特征**：
- **曲霉**：以曲霉烟色变种（Aspergillus fumigatus）为主（占比93%），分生孢子和菌丝均能被FISH检测到。
- **毛霉菌**：常与曲霉混合感染（6/7 BALF样本同时检出两种病原体），且多见于未及时控制免疫抑制状态的病例。
- **酵母菌**：67例（32%）BALF样本中检测到酵母菌，但未明确病原体（如白念珠菌），可能与检测方法覆盖范围有限有关。

3. **宿主因素与感染结局**：
- **中性粒细胞减少**：146例（70%）患者存在中性粒细胞减少，且其BALF中真菌DNA浓度显著高于非中性粒细胞减少患者（P=0.001）。
- **死亡率关联**：确诊/可疑病例中，qPCR或FISH阳性组死亡率达45%-63%，显著高于阴性组（13%-36%）。提示早期检测可改善预后。
- **抗真菌药物使用**：58%患者接受过抗真菌治疗，但未显著影响检测准确性（P>0.05），表明检测方法对药物干扰不敏感。

### 临床意义与局限性
1. **诊断策略优化**：
- **首选检测**：推荐BALF特异性qPCR联合FISH用于快速筛查曲霉和毛霉菌，尤其适用于危重患者（如干细胞移植后）。
- **血清补充检测**：适用于无法获取BALF样本的情况，但需结合影像学（如肺部阴影）提高准确性。

2. **技术局限性**：
- **FISH假阳性风险**：需严格排除非特异性荧光干扰（如红细胞或环境污染物）。
- **qPCR假阴性**：部分病例（如毛霉菌）因DNA提取不充分或降解导致漏检。
- **培养法耗时性**：需7-14天才能完成鉴定，延误治疗窗口。

3. **未来研究方向**：
- **标准化DNA提取流程**：针对不同真菌形态（如分生孢子、菌丝）优化提取方法。
- **联合检测策略**：探索qPCR与FISH联用是否能提升毛霉菌检测率（目前仅1%单独检出）。
- **宿主标志物开发**：结合中性粒细胞减少程度、免疫抑制药物使用史等构建预测模型。

### 结论
本研究证实：
1. **曲霉特异性qPCR**是诊断侵袭性曲霉病的金标准，检测率远超传统培养和FISH。
2. **FISH技术**在辅助鉴别真菌结构（如分生孢子）方面具有独特价值，但需与qPCR互补使用以提高毛霉菌检出率。
3. **血清检测**虽可用于早期筛查，但灵敏度不足，需结合影像学（如CT“反环”）和 BALF检测。

该研究为癌症患者真菌感染的诊断提供了关键证据，建议临床实践中优先采用BALF特异性qPCR，并辅以FISH技术以提高综合诊断准确性。