KLF2基因表达下调会损害肺内皮功能，并促进新生儿持续性肺动脉高压的发生

《Biochemical Pharmacology》：Downregulation of KLF2 impairs pulmonary endothelial function and promotes persistent pulmonary hypertension of the newborn

新生儿持续性肺高血压（PPHN）患儿肺动脉内皮细胞（PAECs）中KLF2表达下调，引发内皮功能障碍和血管重塑。机制涉及MMP-1上调，而药物calycosin激活KLF2可改善上述问题，为PPHN治疗提供新靶点。

　　

陈宁宁|尹晓航|王东|周东梅|康莉莉|李晓颖

山东大学附属儿童医院（济南儿童医院）新生儿科，中国济南

摘要

新生儿持续性肺动脉高压（PPHN）是一种严重且进行性的疾病，治疗选择有限。肺动脉内皮细胞（PAECs）的功能障碍是其发病机制和进展的基础，但具体机制尚不明确。内皮Kruppel样因子2（KLF2）是维持血管稳态的关键转录因子。本研究探讨了KLF2在PPHN中PAEC功能中的作用。我们发现PPHN婴儿的KLF2表达水平降低。在PAECs中沉默KLF2会导致血管活性介质的分泌失调，表现为内皮一氧化氮合酶（eNOS）表达减少而内皮素-1（ET-1）表达增加。此外，KLF2缺陷的PAECs表现出增强的增殖和迁移能力，而KLF2过表达则产生相反的效果。从机制上看，KLF2的丢失通过促进乙酰转移酶p300和RNA聚合酶II在MMP-1启动子处的聚集，从而上调了MMP-1的表达，进而驱动PAEC的增殖和迁移。重要的是，用calycosin药理激活KLF2可以缓解缺氧引起的内皮功能障碍，并减轻新生儿大鼠模型中的肺血管重构。总之，我们的研究结果表明KLF2缺陷会损害PAEC功能并加重PPHN中的肺血管重构。这些结果提示KLF2激活可能是治疗PPHN的有前景的策略。

引言

新生儿持续性肺动脉高压（PPHN）是一种严重且可能致命的疾病，由出生后正常的循环转换失败引起，导致持续的肺血管阻力[1]。PPHN的发病率约为每1000名活产婴儿中有2例，在美国中心的死亡率在4%到33%之间[2,3]。尽管PPHN的护理有所改善，但目前的干预措施往往无法始终产生积极的结果[4, [5], [6]]。因此，发现和表征PPHN发病和进展的新靶点仍然是重要的优先事项。

肺动脉重构是PPHN的标志性特征[7,8]。在肺动脉重构过程中，整个肺动脉壁（包括所有类型的壁细胞）都会受到影响。然而，新的证据表明，内皮细胞（EC）功能障碍是PPHN这一过程的关键驱动因素[8, [9], [10]]。在受到刺激时，肺动脉内皮细胞（PAECs）会呈现出过度增殖和抗凋亡的表型。同时，PAECs释放诸如内皮素等介质，这些介质会促进相邻的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）向更具增殖性的状态转变，最终导致血管重构[11, [12], [13]]。尽管对EC的行为有了越来越多的了解，但关于PPHN中肺动脉重构过程中内皮功能障碍的机制仍知之甚少。

Kruppel样因子2（KLF2）是一种对剪切应力敏感的转录因子，主要在ECs中表达[14, [15], [16], [17]]。近年来，来自成人肺动脉高压（PAH）临床前模型的证据表明，KLF2信号传导的减少参与了PAH的发病机制。例如，KLF2缺陷通过促进内皮-间充质转化（EndMT）而加剧肺血管重构[14]；而KLF2过表达则增加外泌体miR-181a-5p和miR-324-5p的分泌，这些microRNAs通过作用于Notch4和ETS1来减少EC凋亡、NF-κB信号传导和VEGF驱动的增殖[18]。有趣的是，Kuo等人之前发现KLF2敲除小鼠（KLF2^-/-）在胚胎第12.5–14.5天因血管渗漏而死亡[19]，表明KLF2在生命早期血管完整性中起重要作用。然而，KLF2是否参与PPHN中的内皮功能障碍及其潜在机制仍不清楚。

Calycosin是一种天然存在的异黄酮，也是Astragalus membranaceus的有效成分之一，因其对心血管疾病的药理潜力而受到越来越多的关注[20]。临床前研究表明，calycosin可以调节氧化应激、炎症和血管生成信号传导[21,22]，从而对内皮功能产生保护作用。有趣的是，新的证据表明calycosin也可能影响受KLF2调控的通路，进一步凸显了其作为内皮功能障碍治疗剂的潜力[23]。然而，calycosin是否能够改善PPHN中的内皮损伤尚未进行研究。

在本研究中，我们观察到PPHN婴儿的KLF2表达水平降低。在动物模型中，KLF2下调会加重新生儿大鼠缺氧和单克罗塔尔啉诱导的肺动脉重构，而KLF2上调则可以减轻这种重构。从机制上看，KLF2敲低增强了乙酰转移酶p300和RNA聚合酶II（RNA Pol II）在MMP-1启动子处的聚集，从而增加MMP-1的表达，促进PAEC的增殖和迁移，并导致内皮功能障碍。值得注意的是，我们还发现calycosin介导的KLF2药理激活可以缓解缺氧引起的内皮功能障碍，并减轻新生儿大鼠模型中的肺血管重构。总之，我们的发现为进一步研究KLF2作为PPHN潜在治疗靶点奠定了基础。

研究参与者和临床样本

样本来自山东大学附属儿童医院的正常足月新生儿（3例）和PPHN婴儿（3例）。本研究已获得山东大学和山东大学附属儿童医院伦理委员会的批准（SDFE-IRB/T-2025112）。

细胞培养和处理

原代人PAECs从IMMOCELL（中国福建厦门）获得，并在含有5% FBS、1% 内皮细胞生长因子和1% 青霉素/链球菌的ECM中培养（ScienceCell，圣地亚哥）

PPHN婴儿和实验性大鼠PPHN模型中KLF2表达下调

我们首先使用qRT-PCR检测了PPHN患者外周血样本中的KLF2水平。结果显示，PPHN婴儿的KLF2水平低于对照组足月新生儿（降低了20.4%，p = 0.0548）（图1A）。然后我们在PPHN的动物模型中研究了KLF2的表达。为此，我们分别使用慢性缺氧方案和腹腔注射单克罗塔尔啉（MCT）建立了两种不同的PPHN大鼠模型[27]（图1，图1）。肺组织的H&E染色

讨论

PPHN仍然是一种致命的疾病，目前的血管扩张疗法仍不足以治愈它。一个可能的解释是，这些治疗的主要益处仅限于改善内皮血管运动功能，而没有完全解决整体EC功能障碍[34,35]。KLF2是一种特异性内皮转录因子，已被证明是维持EC功能稳态的重要因素[36, [37], [38]]。PPHN婴儿的血液样本显示了这一趋势

作者贡献声明

陈宁宁：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，软件使用，项目管理，方法学研究，资金获取，数据管理。尹晓航：验证，资源提供，方法学研究，调查。王东：验证，软件使用，资源提供，项目管理，方法学研究，调查。周东梅：数据可视化，验证，软件使用。康莉莉：数据可视化，资源提供，数据管理。李晓颖：撰写 – 审稿与编辑，监督

动物处理

山东大学机构动物护理和使用委员会批准了所有涉及动物的实验程序（LS2024040）。缺氧诱导的PPHN大鼠模型是根据先前的方法开发的，略有修改[24,25]。简要来说，共购买了6只处于妊娠期的Sprague-Dawley大鼠，从Vital River Laboratory Animal Technology（北京，中国）购买，并在分娩前至少适应1周。大鼠在足月时出生，并在室温下饲养48小时

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了山东省自然科学基金 [资助编号 ZR2022MH235]和山东省博士后创新计划[资助编号 SDCX-ZG-202502092]的资助。

出版同意

所有作者同意本手稿的发表。