真菌β-1,3-葡聚糖合酶：结构、机制与调控研究新进展——从冷冻电镜结构到抗真菌药物靶点

《FEMS Yeast Research》：Fungal β-1,3-Glucan Synthase: A Review of Structure, Mechanism, and Regulation

本文聚焦于侵袭性真菌感染这一全球健康威胁，系统回顾了真菌细胞壁关键组分β-1,3-葡聚糖合成酶(Fks)的最新研究进展。作者整合了近年来通过冷冻电镜(cryo-EM)解析的Fks及其与Rho1复合物的高分辨率结构，深入探讨了该酶的催化机制、Rho1 GTPase调控方式以及echinocandin类药物的抑制机理。研究揭示了Fks采用独特的DAN催化模体实现金属离子非依赖性合成，提出了"分子齿轮箱"模型解释β-1,3-葡聚糖的跨膜转运机制，并为针对耐药菌株的新一代抗真菌药物研发提供了关键结构基础。

　　

在微生物与人类健康的持久博弈中，侵袭性真菌感染正成为日益严重的全球公共卫生威胁。随着免疫缺陷患者数量的增加和抗真菌药物的广泛使用，耐药性问题愈发突出，特别是耐多药念珠菌耳念珠菌(Candida auris)的出现，使得临床治疗面临严峻挑战。真菌细胞壁作为真菌特有的结构，因其在人体细胞中的缺失而成为理想的抗真菌药物靶点。其中，β-1,3-葡聚糖是绝大多数致病真菌细胞壁的主要结构多糖，负责形成维持细胞形态和强度的核心纤维网络。合成这一关键聚合物的β-1,3-葡聚糖合酶(GS或Fks蛋白)因此成为抗真菌药物研发的重要靶标。

目前临床上广泛使用的echinocandin类药物(如卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净)以及新型三萜类药物ibrexafungerp均以Fks为作用靶点。然而，随着这些药物的长期使用，耐药性问题日益凸显，其主要机制是FKS基因发生点突变。深入了解Fks的分子结构、功能机制及耐药性产生原理，对于开发新一代抗真菌药物至关重要。

近年来，冷冻电镜技术的突破为解析Fks这一重要膜蛋白复合物的结构提供了可能。发表在《FEMS Yeast Research》上的这篇综述文章，由中国农业大学兽医公共卫生安全国家重点实验室的张月平教授团队撰写，系统总结了Fks蛋白在结构、催化机制和调控方面的最新研究进展，特别是基于冷冻电镜结构的新发现。

关键技术方法

本研究主要基于文献综述方法，整合分析了已公开的冷冻电镜结构数据(包括PDB ID: 7XE4、7YUY、8JZN、8WLA、8WL6等)。通过比较野生型和突变型Fks1的结构差异，结合功能实验数据，阐释了酶的作用机制。研究还采用了结构比对分析，将Fks与细菌纤维素合酶(BcsA)、植物纤维素合酶(CesA)等其他糖基转移酶进行进化关系探讨。此外，文章还综合了酶动力学分析、点突变功能验证以及分子建模等方法，构建了Fks的工作模型。

研究结果

2.1 β-1,3-葡聚糖合酶复合物的分子组成

功能性β-1,3-葡聚糖合酶是一个多亚基复合物，其核心组成包括催化亚基Fks和调节亚基Rho1。Rho1是一种属于Ras超家族的小GTP酶，只有处于GTP结合的激活状态时才能激活催化亚基Fks。Rho1的异戊烯化修饰对其膜定位和激活葡聚糖合酶的功能至关重要。

FKS基因在不同真菌物种中的拷贝数存在差异。酿酒酵母(S. cerevisiae)拥有三个同源基因：FKS1、FKS2和FKS3，其中FKS1在营养生长期间主要表达，FKS2在应激条件下表达上调，FKS3主要参与孢子壁形成。白色念珠菌(C. albicans)也有三个同源基因，但FKS1是必需基因，编码主要催化亚基。丝状真菌和新型隐球菌通常只含有单个FKS基因，且为生存所必需。这种基因拷贝数的差异反映了不同真菌的进化策略。

3. Fks蛋白的高分辨率结构解析

冷冻电镜技术近期成功解析了酿酒酵母Fks1的高分辨率结构，包括其apo状态(未结合底物或调节因子)和某些突变体形式，分辨率达到2.47-3.5 ?。这些结构是GT48家族的首个高分辨率结构，为了解其功能机制提供了前所未有的结构基础。

Fks1的结构高度约为105 ?，宽度约95 ?，可分为跨膜区和大的胞质区。其核心催化区域呈现与细菌纤维素合酶BcsA和植物纤维素合酶CesA相似的折叠，即"纤维素合酶样折叠"，揭示了Fks与GT-2家族酶在核心结构上的进化联系。

Fks1的胞质区包含一个N端辅助域(AC域)和一个大的糖基转移酶(GT)域。GT域呈现典型的GT-A型α/β/α三明治折叠。跨膜区包含17个跨膜螺旋(TM1-17)，大致分为两组(TM1-6和TM7-17)。TM7-17区域相对于TM1-6区域倾斜，在结构中间形成一个面向胞质的大空腔。

催化活性位点位于胞质GT域内，靠近膜-胞质界面。研究人员通过与其他糖基转移酶的结构比对和定点突变实验，鉴定出几个关键催化和底物结合残基，包括催化必需的ED模体以及参与UDP-Glc结合的残基。有趣的是，Fks1在典型金属离子依赖性GT-A酶的保守DxD模体对应位置拥有一个DAN模体，功能实验证实这一模体对Fks1功能至关重要。

冷冻电镜结构还揭示了一个假定的跨膜葡聚糖转运通道，位于催化活性位点正下方，跨越整个膜双层。在解析的apo状态结构中，该通道在细胞外侧是关闭的。提出的转运机制涉及底物结合触发的构象变化，这些变化可能包括TM8的外向移动和GT域的向下移动，从而打开通道并将新生的葡聚糖链挤出细胞。

3.5 Fks1-Rho1复合物结构

Rho1作为一种小GTP酶，通过GTP依赖的构象变化调节Fks1的催化活性。最近的冷冻电镜研究解析了酿酒酵母Rho1-Fks1复合物的高分辨率结构(3.40 ?)，阐明了它们的分子结合基础和激活机制。

Rho1以单体形式结合到Fks1的胞质裂隙中，位于糖基转移酶域和四个侧向螺旋之间，形成紧密界面。GTP结合诱导Rho1构象变化，增强其与Fks1的亲和力。结构比较显示，与apo-Fks1相比，Rho1结合的Fks1在GT域和跨膜螺旋方面发生显著位移。这些变化可能通过促进葡聚糖链延伸和跨膜分泌。研究人员提出了一个"棘轮和棘爪"模型：Rho1通过循环GTP/GDP结合驱动Fks1的GT域逐步构象调整，确保持续的β-1,3-葡聚糖合成。

基于这些结构特征，研究人员提出了动态的"分子齿轮箱"模型。Fks1并非静态通道，而是通过协调构象变化主动运输延伸葡聚糖链的机器。该酶在胞质膜侧合成聚合物，并通过机械化学耦合将其运输到周质空间，类似于互锁齿轮将催化能转化为机械功。

4. β-1,3-葡聚糖合成的催化机制

β-1,3-葡聚糖合酶以UDP-葡萄糖为糖基供体底物。催化活性位点负责结合UDP-Glc，动力学分析显示部分纯化的酿酒酵母GS对UDP-Glc的米氏常数约为0.37±0.11 mM，与酵母细胞内UDP-Glc浓度范围一致。

关于葡聚糖链的起始，酶的高度过程性表明起始和延伸是紧密耦合的，可能涉及尚未完全阐明的特定结构特征或蛋白质相互作用。链延伸发生在聚合物的非还原端，纯化酿酒酵母GS的链延伸速率约为50-51.5 s^-1，这是首次报道的核苷酸糖依赖性多糖合酶的链延伸速率。

对产物长度的认识经历了重大修订。早期研究基于粗提物分析估计产物长度较短，但随着纯化方法和分析技术的改进，发现Fks酶能够产生非常长的β-1,3-葡聚糖链，平均聚合度高达6,550±760，与完整酵母细胞壁中分离的β-1,3-葡聚糖的DP值密切匹配。这强有力支持了GS直接合成接近最终长度的结构葡聚糖骨架的模型。

合成的葡聚糖聚合物必须跨膜运输。冷冻电镜结构揭示的跨膜通道被认为是葡聚糖挤出的路径。运输机制被认为涉及酶的构象变化，可能与底物结合、催化和Rho1激活相耦合。

5. β-1,3-葡聚糖合酶的抑制与抗真菌耐药性

Fks作为抗真菌药物靶点的有效性已通过echinocandin类药物的临床成功和ibrexafungerp的开发得到验证。抑制Fks活性会导致细胞壁弱化、渗透失衡和真菌细胞死亡。

echinocandin类药物通过非竞争性机制有效抑制Fks酶活性，从而阻断β-1,3-葡聚糖聚合。值得注意的是，即使在高浓度下，echinocandin可能也无法完全抑制GS活性，最大抑制率稳定在70-80%左右，表明尽管抑制剂结合，残余酶功能仍然存在。

ibrexafungerp是"fungerp"类中首个临床批准的药物，是天然产物enfumafungin的半合成衍生物。它也通过抑制β-1,3-葡聚糖合酶发挥抗真菌作用。其化学结构不同于echinocandin，推测与Fks酶的相互作用方式不同，可能结合到一个重叠但不完全相同的位点，这可能是其对某些echinocandin耐药菌株仍保持活性的原因。

对echinocandin的临床耐药主要源于FKS基因的特定点突变。这些耐药相关突变并非随机分布，而是集中在三个保守的"热点"区域，这些区域可能在药物结合中起关键功能或结构作用，因此突变可以减少echinocandin的抑制效果，同时让酶保留部分活性。

冷冻电镜分析显示，由TM7、TM11和TM12形成的葡聚糖转运通道与药物结合口袋相邻，形成了功能耦合的结构。基于当前结构和功能数据，研究人员注释了三个耐药热点区域，这些区域聚集在一起，可能代表假定的药物结合位点。空间映射表明葡聚糖运输通道与假定的药物结合位点紧密接近，仅由TM8分隔。基于观察到的结构特征，研究人员提出一个模型：药物结合到口袋通过假定的变构耦合限制相邻葡聚糖通道的开放，从而赋予抗真菌活性。

对echinocandin耐药突变体fks1-S643P的结构分析揭示了突变位点附近结合脂质的排列改变。这些结构见解表明了耐药的潜在机制：突变可能直接改变药物结合；或者可能通过改变Fks蛋白的构象、动力学或膜相互作用间接降低抑制剂效力。

6. 不同GT蛋白功能与结构的比较

通过比较真菌β-1,3-葡聚糖合酶、细菌纤维素合酶、植物纤维素合酶、几丁质合酶、透明质酸合酶和甘露糖基转移酶，发现这些酶的多糖产物对各自宿主生物都至关重要。根据CAZy数据库分类系统，BcsA、CesA和Chs通常归类于糖基转移酶家族2，而Fks1归类于GT48家族，但结构研究显示其具有纤维素合酶样折叠和保守的GT-A型糖基转移酶域。

这些酶的结构和功能多样性反映了它们在不同生物中的进化适应。从一个共同的祖先酶出发，它们通过结构域获得、丢失或修饰以及寡聚状态的变化，进化出高度特异化的功能，以满足各自宿主的独特需求。

7. β-1,3-葡聚糖合酶活性、表达与定位的调控

β-1,3-葡聚糖的合成受到多层次精确调控，以确保细胞壁在正确的时间和地点构建和重塑。

Fks催化亚基的活性直接受Rho1 GTP酶调节。酶活性严格依赖于Rho1处于GTP结合的激活状态；GDP结合的Rho1无活性。Rho1自身的活性状态受鸟嘌呤核苷酸交换因子和GTP酶激活蛋白调节。

Fks活性和表达与监测和维护细胞壁完整性的细胞信号通路紧密相连。PKC通路是真菌中一个关键的保守通路。细胞壁应激传感器感知细胞壁扰动并激活Rho1。激活的Rho1一方面直接激活Fks，另一方面激活蛋白激酶C。Pkc1位于MAPK级联的上游，通过磷酸化传递信号，最终激活转录因子来调节一系列细胞壁相关基因的表达。

钙调磷酸酶通路参与应激反应和真菌毒力。在酿酒酵母中，FKS2表达受钙调磷酸酶调节。高渗透压甘油通路和RIM101通路也在细胞壁调节中发挥作用。当细胞壁受损时，这些信号通路被激活，触发补偿反应，通常包括几丁质合成增加和细胞壁蛋白与多糖之间连接的改变，导致细胞壁结构的显著变化。

蛋白质磷酸化是真核生物中普遍存在的调控机制。早期生化研究表明ATP依赖性磷酸化事件可能与GTP协同调节GS活性。虽然材料未明确将Fks蛋白本身的磷酸化作为其主要开关机制，但考虑到关键激酶和磷酸酶参与调节Fks表达和CWI的通路，Fks或Rho1受磷酸化调控的可能性很高。

调节亚基Rho1需要异戊烯化才能正确定位到膜上并激活GS。FKS基因的表达水平受到精确调控，在不同真菌物种和不同生长条件下表达模式不同。作为整合膜蛋白，Fks蛋白必须被正确运输和定位到质膜的特定区域，即活跃细胞壁合成和重塑的部位。

研究结论与意义

近期冷冻电镜对真菌β-1,3-葡聚糖合酶结构的解析揭示了其保守的GT-A折叠和独特的真菌适应性，如通过DAN模体进行β-1,3-葡聚糖合成和Rho1 GTP酶激活。尽管与细菌/植物纤维素合酶存在结构相似性，但Fks在金属非依赖性催化和调控机制方面存在差异。

尚未解决的关键问题包括链起始机制、抑制剂结合细节、物种特异性结构多样性以及动态通道门控机制。未来的重点包括解析Fks旁系同源物结构、探索脂质相互作用，以及利用结构见解设计针对新位点的抑制剂。将静态快照与体内动态和信号通路整合将需要先进的成像技术。

这些进展为理解Fks功能、耐药机制和治疗靶向奠定了基础。特别重要的是，对Fks结构与功能关系的深入理解将为开发针对耐药真菌的新一代抗真菌药物提供关键见解，有望解决当前临床上面临的耐药性挑战。通过针对Fks-Rho1界面或其他变构位点的药物设计，可能能够克服现有echinocandin类药物的耐药性问题，为侵袭性真菌感染的治疗开辟新途径。