利用拉曼活性诊疗用疏水标签实现靶向蛋白质降解的新机制见解

靶向蛋白降解中的新型水溶性疏水标签研究及其双重功能应用

　　
近年来，靶向蛋白降解技术（Targeted Protein Degradation, TPD）在癌症治疗中展现出巨大潜力。传统方法依赖蛋白酶体或自噬途径，但存在效率低、选择性差等问题。其中，水合羟基化标签（Hydrophobic Tagging, HyT）技术通过引入疏水基团诱导目标蛋白错误折叠，从而被细胞降解机制清除。这一机制与PROTACs不同，后者依赖E3连接酶的级联反应，而HyT更依赖于细胞内天然质量控制系统。

本研究聚焦于开发新型HyT标签，并首次将拉曼散射成像（Stimulated Raman Scattering, SRS）技术应用于该领域，实现蛋白降解过程的实时可视化追踪。研究团队以PARP-1为靶点，设计了兼具药物活性和成像功能的HyT-olaparib conjugates（化合物1a–1c和2a–2c）。这些化合物通过将Raman活性基团（如二炔基团）与PARP抑制剂olaparib偶联，既保持了抑制DNA修复的能力，又具备独特的光学性质。

### 关键发现与机制解析
1. **蛋白结合与抑制活性验证**
通过表面等离子共振（SPR）分析，HyT-conjugates与PARP-1的结合常数（K_D）在2.47–3.88 nM之间，接近游离olaparib（K_D=0.73 nM），表明疏水标签的引入并未显著削弱结合能力。酶活性测试显示，所有HyT-conjugates的IC₅₀均低于5 nM，证实其仍保持强效的PARP抑制活性。

2. **蛋白动态结构变化**
通过氢键交换质谱（HDX-MS）观察到，HyT标签与PARP-1的ART域（ADP核糖基转移酶结构域）和催化活性位点结合后，导致蛋白结构局部 unfolding。特别是带有五元环疏水基团（如化合物2a）的探针，与PARP-1的螺旋域（Helical Domain）和WGR结构域（Tryp-Gly-Arg富含区）产生额外相互作用，进一步加剧蛋白构象异常。

3. **细胞降解与毒性增强机制**
在ES-2卵巢癌细胞中，HyT-conjugates展现出显著增强的蛋白降解效果。例如，化合物2c在5 μM浓度下即可使PARP-1降解达55%，其半衰期（DC₅₀=618 nM）与现有HyT降解剂相当。值得注意的是，这类化合物不仅抑制PARP-1功能，还通过激活未折叠蛋白反应（UPR）和自噬途径诱导细胞周期停滞（G2/M期阻滞）和凋亡。质谱组学分析显示，UPR相关基因（如DDIT3/CHOP、XBP1）及自噬标志物（SQSTM1/p62、LC3-II）显著上调，证实双重降解机制的协同作用。

4. **实时成像揭示降解路径**
SRS显微镜观察到，HyT-conjugates在细胞内的分布高度集中于内质网（ER）区域，这与HDX-MS和蛋白组学数据一致。通过对比自噬抑制剂BafA处理组，发现未受抑制的HyT-conjugate（如2a）在ER区富集程度与PARP-1降解效率呈正相关。当抑制自噬后，药物成像信号强度显著增加，表明自噬途径是HyT诱导蛋白降解的重要通路。

### 技术创新与临床应用潜力
本研究首次将SRS成像技术整合到HyT蛋白降解机制研究中，实现了以下突破：
- **机制可视化**：通过实时观察药物在ER区的聚集，直接验证了HyT诱导的ER应激假说。
- **自噬与UPR的协同作用**：结合组学数据与成像结果，揭示了HyT通过双重通路（UPR激活+自噬增强）实现高效蛋白降解的分子机制。
- **高效低毒化**：与olaparib相比，HyT-conjugates的细胞毒性IC₅₀降低至62 nM（约250倍），且在BRCA2 wild-type和突变细胞系中均表现出显著疗效差异，提示其可能克服现有PARPi的耐药性问题。

### 局限性与未来方向
尽管取得重要进展，研究仍存在局限性：
- **降解效率对比**：目前HyT-conjugates的Dmax（最大降解率）为55%，低于PROTACs（通常>90%），可能因疏水标签诱导的构象变化幅度不足。
- **成像灵敏度限制**：SRS信号在细胞核区较弱，未来需开发更高灵敏度的探针或改进成像算法。
- **机制复杂性**：自噬与UPR的交叉调控网络尚未完全解析，需结合更多单细胞组学数据。

未来研究可聚焦于以下方向：
1. **优化标签结构**：通过引入刚性环状疏水基团（如四氢萘环）增强蛋白结合稳定性，或设计可调控的构象开关标签。
2. **开发多模态成像探针**：整合SRS与荧光共振能量转移（FRET），实时监测蛋白降解动态。
3. **扩展靶向蛋白范围**：将该策略应用于其他癌症相关蛋白（如BCL-2、EGFR），并探索与免疫检查点的协同效应。

### 总结
该研究不仅验证了HyT技术的临床转化潜力，更通过成像技术首次直观揭示了蛋白降解的细胞内机制。这种“降解-成像”一体化探针为药物开发提供了新范式——通过实时追踪药物作用路径，加速靶向蛋白降解剂的优化进程。特别在卵巢癌治疗领域，这类化合物可能成为突破PARPi耐药瓶颈的关键工具。