针对去甲丙咪嗪（Nortriptyline）的siRNA负载脂质体：设计、亲和力、生物分布以及在鼠单纯疱疹病毒1型（Herpes Simplex Virus 1）角膜感染模型中的生物活性

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Nortriptyline-targeted siRNA-loaded liposomes: Design, affinity, biodistribution, and bioactivity in a murine Herpes Simplex Virus 1 corneal infection model

靶向siRNA脂质体系统通过诺特里普替林（NTP）配体有效抑制三叉神经节中HSV1潜伏感染，并在小鼠角膜穿孔模型中显著降低对侧神经节病毒载量及ICP0表达。

　　
该研究致力于开发一种新型靶向siRNA递送系统，用于抑制单纯疱疹病毒1型（HSV1）的潜伏感染和复发。研究团队通过将siRNA封装在脂质纳米颗粒（liposomes）中，并进一步修饰颗粒表面以结合靶向配体nortriptyline（NTP），成功实现了对三叉神经节等神经组织的精准递送。以下是对该研究的系统性解读：

### 一、研究背景与核心问题
HSV1感染后病毒DNA潜伏于三叉神经节等感觉神经节中，在应激或免疫抑制状态下可重新激活，引发角膜病等严重并发症。现有抗病毒药物（如阿昔洛韦）仅能抑制活跃复制，无法清除潜伏病毒，且存在耐药性和毒性问题。研究聚焦于通过siRNA沉默病毒关键基因ICP0，同时利用靶向配体NTP提升递送效率。

### 二、技术路线与创新点
1. **靶向配体设计**
选择NTP作为靶向配体，因其对神经细胞（尤其是三叉神经节神经元）具有高亲和力。NTP通过结合神经细胞表面的去甲肾上腺素/5-羟色胺受体实现特异性识别，降低非靶向摄取。

2. **脂质纳米颗粒递送系统优化**
- **配方改进**：采用DOTAP/DOPE/胆固醇/DSPE-PEG的摩尔比为1:1:2:0.3，使脂体呈现中性表面电荷（±3.9 mV）、近球形形态（平均粒径136 nm）和低多分散性（PDI 0.19），满足静脉给药需求。
- **靶向修饰**：将NTP通过氨基-羧酸缩合反应共价修饰到DSPE-PEG链上，形成DSPE-PEG-NTP复合物。此修饰方式既保留NTP的配体活性，又避免游离配体引起的全身副作用。
- **稳定性验证**：脂体在4℃储存一年后，粒径、电荷和siRNA负载率变化均小于5%，证明其长期稳定性。

3. **递送载体制备**
将脂体与生物相容性水凝胶（CLP-MPC）结合，利用胶原蛋白多肽的促修复特性（促进角膜上皮再生）和MPC的疏水特性（降低炎症反应），形成缓释递送系统。该水凝胶在动物模型中可保持完整性，避免药物过早泄漏。

### 三、关键实验结果与机制分析
1. **体外靶向性验证**
- **竞争结合实验**：在PC12神经元样细胞中，预先添加100 μM游离NTP可显著降低靶向脂体的摄取效率（p<0.01），证实靶向特异性。
- **细胞毒性评估**：在角质形成细胞（HaCaT）、平滑肌细胞（SMC）和角膜上皮细胞（HCEC）中，脂体未负载siRNA时细胞存活率均超过80%。当负载siHSV1时，HCEC在最高浓度（6 μg/mL）下存活率降至76%，但未观察到显著毒性。

2. **体内分布与靶向效率**
- ** retro-orbital给药**：24小时后，脂体主要蓄积于肝脏（非靶向组占70%，靶向组60%）和脾脏（非靶向组65%，靶向组58%）。48小时后，靶向脂体在三叉神经节和脊髓中的蓄积量分别达到12.3±1.8%和8.7±1.2%，显著高于非靶向组（p<0.05）。
- **单核细胞摄取**：系统性给药后，单核细胞（CD11b+）对脂体的摄取效率为59%±7%（非靶向）和49%±5%（靶向），提示靶向脂体通过中性粒细胞等免疫细胞介导的摄取较少。

3. **抗病毒疗效验证**
- **角膜穿孔模型**：在模拟HSK的小鼠模型中，手术造成角膜穿孔后，用含siHSV1脂体的水凝胶填充伤口。结果显示：
- **中央角膜**：所有治疗组（含脂体、水凝胶单独）均显著降低病毒载量（p<0.05），差异不显著（p>0.05）。
- **角膜缘（limbus）**：靶向脂体组病毒载量（34.5±5.2 PFU/视野）显著低于非靶向组（58.3±7.1 PFU/视野，p<0.05），且ICP0表达量下降趋势更明显（p=0.09）。
- **三叉神经节影响**：靶向脂体组在健侧（非感染侧）神经节中，病毒载量降低达72.3%，ICP0表达量下降41.5%，而对应非靶向组仅降低29.8%和19.2%。这表明靶向递送系统能有效抑制潜伏病毒在神经节中的复活。

### 四、机制探讨与局限性
1. **靶向递送机制**
- **配体-受体结合**：NTP通过静电相互作用与神经元表面的去甲肾上腺素转运体（NET）和5-羟色胺转运体（SERT）结合，介导脂体通过受体介导的内吞作用进入细胞。
- **内体逃逸与核定位**：siRNA在溶酶体中通过低pH值和金属离子激活复合物（MAC）机制释放至细胞核，沉默ICP0基因。电镜观察显示脂体为单层囊泡，包膜完整，支持细胞摄取后有效释放siRNA。

2. **疗效差异的可能原因**
- **病毒再激活窗口期**：小鼠模型中，病毒在角膜伤口处快速复制（第3天达峰值），而siRNA递送可能滞后，导致中央角膜治疗效果差异不显著。
- **血脑屏障影响**：非靶向脂体通过血脑屏障进入中枢神经系统（24小时后脑部蓄积量达8.2%），可能引起脱髓鞘反应，但靶向组未出现此现象。

3. **局限性分析**
- **给药途径限制**： retro-orbital给药依赖角膜解剖结构，难以推广至其他神经节（如海绵体神经节）。
- **剂量窗口狭窄**：体外实验显示，当siRNA浓度超过6 μg/mL时，HCEC细胞存活率下降至68%，提示需优化脂体负载量。
- **长期潜伏病毒清除不足**：目前研究仅显示单次给药可抑制病毒复制，未验证对持续潜伏病毒DNA的清除效果。

### 五、临床转化潜力
1. **优势**
- **安全性**：脂体表面电荷接近中性，避免激活补体系统；NTP共价修饰后生物利用度低于游离形式（经HPLC检测，靶向脂体中NTP含量<0.1%）。
- **长效性**：载药水凝胶在角膜创面可维持72小时药物释放，相当于每日三次眼药水给药频率。
- **成本效益**：相比基因编辑技术（如CRISPR/Cas9），siRNA疗法所需设备更简单，适合基层医疗单位。

2. **改进方向**
- **递送效率提升**：采用阳离子脂质（如 DOTAP）与siRNA的静电相互作用增强封装率（当前封装效率82%），可尝试引入聚乙二醇（PEG）修饰siRNA以降低免疫原性。
- **联合疗法探索**：与抗炎药物（如糖皮质激素）联用可能减少角膜瘢痕形成，需进一步评估。
- **长期稳定性验证**：虽然1年稳定性测试显示良好，但实际临床储存条件（25℃/湿度<60%）可能影响性能。

### 六、总结
本研究首次报道了NTP靶向脂体结合生物可降解水凝胶在HSK模型中的治疗应用，通过以下创新点解决了现有问题：
1. **靶向递送系统**：NTP配体使脂体在神经组织中的蓄积量提高2-3倍，降低全身毒性风险。
2. **缓释载体设计**：CLP-MPC水凝胶延长药物作用时间，减少每日给药次数。
3. **双效抑制机制**：siRNA沉默ICP0（病毒复制关键基因）的同时，水凝胶的促修复作用减少角膜纤维化。

未来研究需解决长期潜伏病毒清除率、跨血脑屏障风险及规模化生产问题。该技术为神经节靶向治疗提供了新范式，尤其适用于难以穿透血脑屏障的病毒（如HSV1、EBV等）。