Obacunone 通过抑制肠道缺血-再灌注损伤中的线粒体活性氧（ROS）和 MIF 信号通路，从而阻断 RIPK1/RIPK3/MLKL 介导的坏死性凋亡

《International Immunopharmacology》：Obacunone inhibits RIPK1/RIPK3/MLKL-mediated necroptosis by suppressing mitochondrial ROS and MIF signaling in intestinal ischemia-reperfusion injury

本研究探讨Obacunone（OBA）对肠道缺血再灌注（IIR）损伤的保护作用及机制。通过体内外实验，发现OBA预处理显著减轻IIR引起的肠道上皮损伤，抑制RIPK1/3/MLKL磷酸化，降低mtROS积累，并通过靶向MIF双重调节坏死性凋亡。该研究为中药治疗IIR提供了新策略。

　　

Xiao-yao Li|Jing-yuan Xie|Yu-tong Yin|Xiao-guo Weng|Zi-yi Huang|Lu-si Wang|Ke Ding|Rong Chen|Qing-tao Meng

武汉大学人民医院麻醉科，中国武汉

摘要

背景

肠缺血-再灌注（IIR）是一种严重的病理生理事件，与高发病率和死亡率相关，常导致肠道屏障破坏和全身炎症反应。Obacunone（OBA）是一种天然存在的柠檬苦素化合物，具有已证实的抗氧化和抗炎作用，但此前尚未在IIR背景下进行过研究。本研究旨在评估其对IIR诱导的损伤的保护作用。

方法

使用体内IIR小鼠模型和体外IEC-6细胞模型（暴露于缺氧-再氧合（OGD/R）条件下）来评估OBA的保护作用。通过组织学分析、免疫组化、免疫荧光和Western blotting技术评估组织损伤和坏死性凋亡。通过JC-1染色、MitoSOX荧光和透射电子显微镜检测线粒体功能和ROS生成。通过网络药理学和分子对接技术识别潜在的OBA靶点，随后使用MIF抑制剂ISO-1和重组MIF蛋白进行药理学验证。

结果

OBA预处理显著减轻了IIR引起的肠道损伤，恢复了上皮完整性，并抑制了RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化。OBA减少了ROS的积累，抑制了线粒体ROS（mtROS）的产生，并保持了线粒体形态和膜电位，从而抑制了坏死性凋亡。网络药理学和分子对接技术确定巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是OBA的潜在靶点。MIF的抑制作用模仿了OBA的保护效果，而外源性MIF部分逆转了这些效果，表明OBA通过同时调节mtROS和MIF信号通路来抑制坏死性凋亡。

结论

OBA通过调节mtROS和MIF驱动的坏死性凋亡来保护肠道上皮免受IIR损伤，为肠缺血-再灌注损伤及相关炎症性疾病提供了有前景的治疗策略。

引言

肠缺血-再灌注（IIR）损伤是一种临床病理生理过程，可导致黏膜上皮广泛死亡、绒毛和隐窝丧失以及肠道屏障功能障碍，从而引发严重的并发症，死亡率高达50-90%。临床上，IIR可见于急性及慢性肠梗阻、急性肠系膜栓塞、小肠移植和低血压性休克等情况。研究表明，多种机制（如氧自由基的积累、钙超载以及多种细胞死亡途径，包括凋亡、铁死亡、自噬、焦亡和坏死性凋亡）参与了IIR的发病机制。

坏死性凋亡是一种程序性细胞死亡形式，其特征是细胞肿胀、质膜损伤和损伤相关分子模式（DAMPs）的释放。该过程主要由受体相互作用蛋白激酶RIPK1和RIPK3以及下游效应因子MLKL介导[1]。RIPK3和MLKL的激活也被认为是坏死性凋亡的生物标志物。体内和体外研究均证实了坏死性凋亡及其随后的坏死性炎症在IIR中的关键作用[2,3]，表明抑制坏死性凋亡可以减轻肠道上皮细胞丢失并恢复IIR后的肠道黏膜屏障功能[4,5]。

越来越多的研究强调了中药在治疗多种疾病（包括炎症和癌症）中的重要作用。Obacunone（OBA）是一种从Dictamnus dasycarpus或Phellodendron amurense中提取的天然柠檬苦素化合物，在传统中药中广泛应用。OBA因其多样的药理活性（包括神经保护、抗糖尿病、抗过敏和抗病毒作用）而受到研究人员的关注。多项研究表明，OBA可以抑制NF-κB信号通路及TNF-α、IL-6和NO等炎症因子的表达[6]。此外，OBA具有强抗氧化作用，并能激活Nrf2通路，促进HO-1转录[7]，从而抑制细胞内钙流入和活性氧（ROS）的过量产生[8]，从而在多种疾病模型中缓解氧化应激和炎症[8]。另有研究显示，OBA通过靶向MIF可减轻盆腔疼痛并抑制巨噬细胞极化[9]。最近的研究表明，OBA在卵巢切除术后通过靶向MIF发挥抗炎和抗骨质疏松作用[10]。

多项研究显示，ROS参与了RIPK1对RIPK3的招募，以及RIPK1和RIPK3的自我激活[11, [12], [13]]，并且一些坏死性凋亡途径组分的抑制剂（如Necrostatin-1（Nec-1，RIPK1抑制剂）、GSK-872（RIPK3抑制剂）和Necrosulfonamide（MLKL抑制剂）能够显著挽救坏死性凋亡细胞[14]。同时，MIF是一种促炎因子，其抑制剂常用于治疗严重败血症[15]、类风湿性关节炎[16]、过敏性气道炎症[17]、结肠炎[18]、慢性阻塞性肺疾病[19]等炎症性疾病[20, [21], [22]]。先前的研究表明，在肠缺血-再灌注损伤模型中，MIF缺乏的小鼠表现出较低的肠道损伤、较低的死亡率和较轻的肺损伤[23]。这些发现表明，mtROS和MIF是肠道损伤中坏死性凋亡的重要上游调节因子。

然而，Obacunone是否通过靶向这些通路来抑制坏死性凋亡从而减轻IIR损伤尚不清楚。在本研究中，我们建立了体内和体外IIR模型以评估OBA的保护作用。本研究旨在阐明OBA调节坏死性凋亡信号通路的上游机制，并探索其在治疗肠缺血-再灌注损伤中的潜在疗效。

部分内容

动物

来自中国宜昌三峡大学的雄性C57BL/6小鼠为特定病原体-free（SPF）动物。实验前，这些小鼠已适应环境，并正常进食和饮水。手术前一周，小鼠每天接受OBA腹腔注射。根据初始剂量-反应评估确定OBA的最佳剂量为15 mg/kg。所有后续实验均使用该有效剂量进行。

对于每个体内实验，均设置了生物重复实验

OBA可减少IIR后的肠道上皮损伤和坏死性凋亡

为了探讨OBA对IIR的保护作用，我们首先评估了肠道的组织病理学变化。HE染色显示，与假对照组相比，IIR组存在明显的上皮细胞损伤和丢失、炎症细胞浸润、绒毛长度显著缩短以及毛细血管扩张。随后，小鼠分别接受低剂量（5 mg/kg，OBA-L）或高剂量（15 mg/kg，OBA-H）的OBA预处理。组织学评分结果显示，OBA-H组的效果更为显著

讨论

肠缺血-再灌注（IIR）损伤具有高发病率和死亡率，给医疗系统带来了巨大负担，因此开发有效的治疗方法迫在眉睫。中药具有独特的优势，如副作用小且具有广泛的抗炎作用。Obacunone已显示出抗糖尿病、抗结肠炎、保护肠道和抗氧化作用。在本研究中，我们首次证明了

作者贡献声明

Xiao-yao Li：软件开发、方法学设计、概念构思。Jing-yuan Xie：初稿撰写。Yu-tong Yin：数据可视化、实验研究。Xiao-guo Weng：实验监督。Zi-yi Huang：数据可视化。Lu-si Wang：数据管理。Ke Ding：实验研究。Rong Chen：结果验证、软件应用。Qing-tao Meng：论文撰写及审稿。

资助

本工作得到了国家自然科学基金（82172155, 82202410）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。