AMPK磷酸化WIP1促进DNA修复及肿瘤细胞放射抵抗的新机制

《Cell Death & Disease》：AMPK phosphorylates WIP1 to promote DNA repair and radioresistance in cancer cells

本研究针对代谢应激如何调控DNA损伤修复（DDR）这一关键科学问题，揭示了AMPK（AMP-activated protein kinase）通过直接磷酸化磷酸酶WIP1（Wild-type p53-induced phosphatase 1）的Thr25位点，增强其蛋白稳定性及与γH2AX的结合能力，进而促进DNA双链断裂（DSB）修复并导致肿瘤细胞放射抵抗的全新信号通路。该发现为理解代谢与基因组稳定性间的联系提供了实验证据，并为肿瘤放疗增敏策略提供了潜在靶点。

　　

在我们的细胞中，DNA每时每刻都面临着来自内源（如活性氧ROS）和外源（如电离辐射）的威胁，维持其稳定性是生命健康的基础。一旦DNA发生损伤，特别是最严重的DNA双链断裂（DSB），细胞会迅速启动一套复杂的DNA损伤应答（DDR）机制进行修复。组蛋白H2AX在Ser139位点的磷酸化，形成γH2AX，是DSB发生的最早期标志事件之一，它像一面“旗帜”，招募大量修复蛋白到损伤位点，形成可见的核焦点（foci）。然而，当损伤修复完成后，这面“旗帜”必须被及时撤下（即去磷酸化），以恢复基因组稳态，为应对下一次损伤做好准备。究竟是谁负责撤下这面关键的“旗帜”？这个过程又是如何被精确调控的？这些问题的答案对于理解基因组稳定性维持以及肿瘤（其发生发展与基因组不稳定性密切相关）的治疗抵抗至关重要。

另一方面，细胞代谢状态与DNA损伤修复之间存在深刻联系。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是细胞的核心能量感受器，在能量匮乏时被激活，重编程代谢以应对压力。近年来越来越多的证据表明，AMPK也参与调控DDR，但其具体分子机制仍不清晰。尤其值得深思的是，作为公认的抑癌因子，AMPK在已癌变的细胞中扮演的角色却复杂得多，甚至可能促进肿瘤细胞的存活，这种“双刃剑”效应背后的机制亟待阐明。

发表在《Cell Death and Disease》的这项研究，正是从“葡萄糖剥夺可快速降低γH2AX水平”这一有趣现象入手，层层深入，最终揭示了AMPK通过直接磷酸化磷酸酶WIP1，从而促进DNA损伤修复和肿瘤细胞放射抵抗的全新通路。

研究人员综合运用了多种关键技术方法：利用基因敲除（KO）、敲低（KD）及过表达细胞模型进行功能验证；通过免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down分析蛋白质相互作用；采用体外激酶实验和磷酸化特异性抗体鉴定AMPK对WIP1的直接磷酸化位点；通过蛋白质稳定性分析（环己酰亚胺CHX追踪）和体外去磷酸化实验评估磷酸化对WIP1功能的影响；通过彗星实验（Comet assay）和免疫荧光（IF）焦点分析评估DNA损伤与修复；并利用裸鼠异种移植瘤（CDX）模型和临床乳腺癌组织样本的免疫组化（IHC）分析进行体内验证。

Activation of AMPK promotes dephosphorylation of γH2AX

研究人员发现，在不同类型的细胞（悬浮白血病细胞MOLM13、THP1和贴壁细胞293T、MCF7）中，葡萄糖剥夺或使用AMPK特异性激动剂（A769662, MK-8722）激活AMPK，均能迅速降低γH2AX的水平。这种效应并非主要通过调节ROS实现，并且在AMPK α1/α2双敲除（DKO）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中消失，表明AMPK的激活确实能促进γH2AX的去磷酸化，且该过程是AMPK依赖性的。

WIP1 is the primary phosphatase responsible for maintaining the γH2AX level

那么，AMPK是通过激活哪个磷酸酶来行使这一功能呢？以往研究提示PP2A或PP4C可能负责γH2AX的去磷酸化。但本研究发现，在293T和HeLa细胞中敲低PP4C，或过表达PP2AC、PP4C，均未能显著影响γH2AX水平。相反，过表达WIP1能强力降低基础状态和DNA损伤剂（CPT）诱导下的γH2AX水平，并使其焦点完全消失；而敲低WIP1则导致γH2AX水平及其焦点持续升高。这些结果明确提示，在正常和损伤条件下，WIP1而非PP2A或PP4C，是负责γH2AX去磷酸化的主要磷酸酶。

AMPKa directly binds to WIP1

接下来，研究证实了AMPK与WIP1之间存在直接相互作用。免疫共沉淀和体外GST pull-down实验均表明，AMPK的催化亚基AMPKα2能与WIP1直接结合。结构域映射分析将相互作用区域定位于WIP1的101-372氨基酸区段。有趣的是，WIP1能促进活化的AMPK（磷酸化形式）在细胞核内积聚，提示二者相互作用可能具有功能上的协同效应。

AMPK phosphorylates WIP1 at Thr25

核心问题在于AMPK如何调控WIP1。通过质谱分析和点突变筛选，研究团队发现AMPK能够直接磷酸化WIP1的第25位苏氨酸（Thr25）。该位点在多种脊椎动物中高度保守。他们成功制备了识别p-WIP1 (T25)的特异性抗体，并通过体外激酶实验证实，活化的AMPK复合物能使野生型WIP1（WT）而非T25A突变体发生磷酸化。激活AMPK能显著增强内源性和外源性WIP1在T25位点的磷酸化水平。更重要的是，体外去磷酸化实验表明，与WT相比，T25A突变体去磷酸化γH2AX的酶活性显著降低，而模拟持续磷酸化的T25D突变体则活性更强。这证明AMPK对WIP1 Thr25的磷酸化增强了其磷酸酶活性。

The phosphorylation of Thr25 by AMPK increases WIP1 stability and enhances its binding affinity with γH2AX

机制探讨表明，AMPK介导的磷酸化从两方面增强了WIP1的功能。其一，磷酸化增强了WIP1的蛋白稳定性。T25A突变体比WT蛋白降解更快，泛素化水平更高，而在AMPK敲除细胞中，WIP1的降解也加速。AMPK激活剂能稳定WIP1蛋白，而抑制剂则相反。其二，磷酸化增强了WIP1与底物γH2AX的结合能力。T25A突变体与γH2AX的结合量显著低于WT，并且其在染色质上的结合也更不牢固，更容易被盐溶液洗脱。这表明Thr25磷酸化通过增强WIP1的稳定性和对其底物γH2AX的亲和力，共同促进了γH2AX的有效去磷酸化。

WIP1 Thr25 is critical for DSB repair and radioresistance of cancer cells

最后，研究在细胞和动物水平验证了该通路的生物学功能。在WIP1敲除的MCF7和HeLa细胞中回补WIP1 WT或T25A突变体，发现尽管电离辐射（IR）初期两者DNA损伤程度相似，但T25A细胞在6小时和12小时后仍存在显著的彗星尾和持续的γH2AX焦点，表明DSB修复延迟。同样，表达酶活失活突变体D314A或使用WIP1抑制剂也会导致修复缺陷。体内成瘤实验显示，与表达WT的肿瘤相比，表达T25A的肿瘤对局部X射线照射更为敏感，生长受到显著抑制。对临床乳腺癌组织样本的分析进一步显示，AMPK活性与WIP1 T25磷酸化水平呈显著正相关。这些结果强有力地证明，AMPK磷酸化WIP1 Thr25对于有效的DSB修复和癌细胞的放射抵抗至关重要。

P<0.05,P<0.01,**P<0.001 by 1-factor ANOVA with a post hoc t-test. Insignificant comparison(n.s) was not presented.'>

综上所述，这项研究清晰地描绘了一条从代谢应激信号到DNA损伤修复调控的新通路：AMPK → WIP1 (Thr25) → γH2AX → DSB修复/放射抵抗。该发现不仅深化了对代谢与基因组稳定性交叉对话的理解，更揭示了AMPK在肿瘤中的“双刃剑”角色：在正常细胞中，AMPK-WIP1轴通过促进修复维护基因组稳定，发挥抑癌作用；而在癌细胞中，该通路却被劫持用以抵抗放疗等基因毒性压力，促进肿瘤存活。这提示，针对AMPK-WIP1轴的干预策略需要高度精准的时空和细胞类型特异性。抑制该通路可能成为增敏肿瘤放疗的潜在新策略，但必须谨慎权衡其对正常组织基因组稳定性的潜在影响。这项研究为开发新的肿瘤治疗组合方案提供了重要的理论依据和潜在的分子靶点。