使用四种非酿酒酵母发酵诺丽果浆中代谢物的分析

本研究评估了四种非酿酒酵母（M. pulcherrima Flavia、P. kluyveri Frootzen、C. versatilis NCYC1433、W. saturnus NCYC22）对干燥蓝莓果浆（DNFS）发酵的影响。发现P. kluyveri Frootzen发酵后显著提升挥发性酯类（如异丁酸乙酯、苯乙醇乙酯）浓度，同时降低不良风味化合物（n-癸酸）含量，其细胞数增长至7.07 log CFU/mL，而其他菌株表现不佳。发酵过程未显著改变DNFS的多酚和抗氧化成分，表明该菌株可作为发酵起点，改善蓝莓制品的感官品质和营养价值。

　　
### 干燥非伊果泥浆（DNFS）发酵中非酿酒酵母的应用及其对风味与营养的影响分析

#### 1. 研究背景与意义
非伊果（*Morinda citrifolia* L.）作为一种重要的热带水果，富含天然活性成分，如iridoids（如deacetylasperulosidic acid, DAA和asperulosidic acid, ASPA）和酚类化合物（如槲皮素、绿原酸等），这些成分赋予其显著的抗氧化和抗炎特性。然而，非伊果果肉的高挥发性脂肪酸（如n-decanoic acid）导致其风味难以被消费者接受，且易受微生物污染影响保质期。传统干燥处理虽能延长货架期，但可能破坏部分活性成分。因此，研究非酿酒酵母在发酵过程中对风味物质和营养成分的影响，成为改善非伊果产品商业价值的关键。

非酿酒酵母（non-Saccharomyces yeasts）近年来在食品工业中备受关注，因其能通过代谢活动生成酯类、醇类等芳香物质，同时降解异味成分。例如，已有研究表明，*Pichia kluyveri* Frootzen在发酵茶和咖啡豆时可显著提升果香风味；而*Williopsis saturnus* NCYC22在榴莲发酵中能增加酯类物质浓度。然而，这些非酿酒酵母在非伊果基发酵中的应用尚不明确，尤其是对iridoids等关键活性成分的保留效果。

#### 2. 实验设计与方法
研究选取四种非酿酒酵母（*Metschnikowia pulcherrima* Flavia、*Pichia kluyveri* Frootzen、*Candida versatilis* NCYC1433、*Williopsis saturnus* NCYC22），通过14天静态发酵实验，系统评估其对DNFS理化性质、挥发性成分及活性物质的影响。实验流程如下：

**2.1 菌株与培养基**
- **菌株来源**：所有菌株均从国家酵母菌保藏中心（NCYC）或商业供应商获取，经纯培养确认。
- **培养基配置**：以YM培养基（含酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖和硫酸镁）为基础，调整pH至5.0，补充0.64 g/L酵母提取物作为氮源。
- **预培养**：所有菌株先在含糖培养基中预培养24小时，离心洗涤后用于接种。

**2.2 发酵体系**
- **原料处理**：干燥非伊果果肉经研磨、筛分（200目）后与80 mL去离子水混合，添加2 g/L葡萄糖和0.64 g/L酵母提取物，调节pH至5.5，121℃高压灭菌15分钟。
- **接种与发酵**：按0.5%体积比接种，20℃静置发酵14天，每日取样检测pH、糖度及微生物生长情况。

**2.3 检测指标**
- **微生物学分析**：通过平板计数法监测酵母菌的增值与存活率。
- **理化性质**：测定糖度（折光仪）和pH（pH计）。
- **非挥发性成分**：采用HPLC检测有机酸（包括丙酸、乙酸等）、酚类（槲皮素、绿原酸等）及iridoids（DAA、ASPA）含量。
- **挥发性成分**：通过固相微萃取（SPME）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析酯类、醇类、醛类等成分。
- **抗氧化活性**：采用福林-酚（Folin-Ciocalteu）法测定总酚含量。

#### 3. 关键研究结果分析
**3.1 酵母菌的生长性能**
- ***P. kluyveri* Frootzen** 表现最佳，初始菌数约5.5 log CFU/mL，发酵14天后达7.07 log CFU/mL，增值率约28%。
- ***W. saturnus* NCYC22** 菌数从5.47 log CFU/mL增至5.99 log CFU/mL，增值率9.6%。
- ***C. versatilis* NCYC1433** 和 **M. pulcherrima* Flavia** 菌数在发酵后期显著下降（分别降至3.42和4.92 log CFU/mL），可能与非伊果高酚含量抑制生长有关。

**3.2 理化性质动态变化**
- **pH下降**：*P. kluyveri* Frootzen和*W. saturnus* NCYC22的pH从初始5.5降至4.8-4.9，主要归因于有机酸（丙酸、乙酸）的积累。其中，乙酸浓度在*W. saturnus* NCYC22组达1.2 g/L，显著高于其他组。
- **糖度消耗**：所有菌株均显著降低糖度（葡萄糖从17 g/L降至10-11 g/L），*P. kluyveri* Frootzen组糖耗最显著（初始17 g/L降至11 g/L）。
- **有机酸代谢**：丙酸和乙酸为发酵主要产物，其中*P. kluyveri* Frootzen组丙酸浓度达0.38 g/L，显示较强的三羧酸循环活性。

**3.3 活性成分的保留与转化**
- **Iridoids总量**：发酵后所有组别iridoids总量均略有上升（2-5%），其中*P. kluyveri* Frootzen组DAA增加51.14 mg/L，*M. pulcherrima* Flavia组ASPA增加6.72 mg/L。
- **酚类物质变化**：槲皮素、绿原酸等总酚含量在发酵初期上升（可能与细胞壁分解有关），但14天后整体下降约5-8%。值得注意的是，*P. kluyveri* Frootzen组绿原酸减少量达16.89-316.78 μg/L，可能与酵母分泌的酯酶活性增强有关。
- **氨基酸代谢**：*P. kluyveri* Frootzen组精氨酸和氨氮含量显著降低（降幅达15%），而丝氨酸和谷氨酸含量略有波动，显示其代谢途径与糖代谢密切相关。

**3.4 挥发性香气成分的调控**
- **酯类生成**：*P. kluyveri* Frootzen组异丁基乙酸（isoamyl acetate）达291.41 μg/L，2-苯基乙醇酸酯（2-phenylethyl acetate）达689.69 μg/L，这些成分与香蕉、梨、玫瑰等果香密切相关。而*W. saturnus* NCYC22组2-苯基乙醇酸酯浓度达316.78 μg/L，接近*P. kluyveri*组水平。
- **异味物质降解**：n-decanoic acid（典型“奶酪”异味前体）浓度在*P. kluyveri* Frootzen组从1124.14 μg/L降至827.35 μg/L，降幅达27%。此外，*W. saturnus* NCYC22组正戊酸（pungent acid）减少幅度达34%，显著改善风味。
- **硫醚类降解**：所有菌株均降低3-甲硫基丙醛（3-methylthio-propanal）浓度，其阈值约50 μg/L，而发酵后该物质浓度均低于阈值，表明酵母具有代谢硫醚类的能力。

**3.5 抗氧化与功能性成分的平衡**
- **总酚含量**：发酵后总酚量略有波动（±5%），但未出现显著下降，表明酵母发酵未破坏非伊果的抗氧化基础。
- **iridoids生物转化**：*P. kluyveri* Frootzen组ASPA增加6.72 mg/L，可能与DAA向ASPA的异构化反应有关，需进一步验证其代谢途径。

#### 4. 机制探讨与工业应用潜力
**4.1 酵母代谢途径的差异**
- ***P. kluyveri* Frootzen**：高增值率（+28%）与高效酯合成能力（尤其是异丁基乙酸）相关，可能通过Ehrlich途径（氨基酸→酯类）和乙酰-CoA途径（脂肪酸→酯类）协同作用。
- ***W. saturnus* NCYC22**：虽增值率较低（+9.6%），但通过降解硫醚类物质（如3-甲硫基丙醛）和增加2-苯基乙醇酸酯，同样改善风味。
- **抑制因素**：非伊果高浓度酚类（如绿原酸、咖啡酸）可能抑制*C. versatilis* NCYC1433和*M. pulcherrima* Flavia的生长，这与前期研究一致（Soares et al., 2021）。

**4.2 关键风味物质的形成与调控**
- **酯类生成**：酵母通过酯酶（如脂肪酶）将长链脂肪酸（如n-decanoic acid）转化为短链酯类（如异丁基乙酸），降低异味阈值。研究表明，*P. kluyveri* Frootzen的酯合成酶活性比其他菌株高2-3倍（Zhou et al., 2025）。
- **酚类降解**：*P. kluyveri* Frootzen可能分泌漆酶（laccase）或酚氧化酶（peroxidase），将绿原酸等酚类氧化为醌类或小分子酸，从而减少苦涩感。
- **酒精与挥发性醇类**：发酵过程中生成乙醇（2-4% vol）和苯乙醇（*P. kluyveri*组达690 μg/L），其阈值分别为8% vol和100 μg/L，显著提升产品香气层次。

**4.3 营养功能成分的保留策略**
- **iridoids保护**：温和的pH下降（ΔpH=0.7）和有机酸积累（尤其是乙酸）可能抑制酶解iridoids的关键酶（如β-葡萄糖苷酶），从而保留DAA和ASPA的活性形式。
- **糖酸平衡**：发酵后pH降至4.8-4.9，接近iridoids的稳定pH范围（4.5-5.5），有助于维持iridoids的抗氧化活性。

#### 5. 工业化应用建议
1. **菌株筛选**：优先选择*P. kluyveri* Frootzen和*W. saturnus* NCYC22，因其兼具高增值率、异味降解能力及酯类合成优势。
2. **工艺优化**：
- **接种量**：需确定最佳初始接种量（研究显示0.5%体积比可能偏低，需通过响应面法优化）。
- **发酵时间**：14天发酵可充分降解异味物质，但需评估iridoids含量是否达到峰值。
- **后处理**：添加0.1%乙二醇抑制乙酸酯水解，或通过低温浓缩保留香气活性成分。
3. **感官验证**：建议通过三角形测试确认消费者对“奶酪味”的耐受阈值，并开发风味掩蔽技术（如添加低浓度香兰素）。

#### 6. 研究局限性及未来方向
- **菌株多样性不足**：仅测试4种非酿酒酵母，需扩展至更多广谱性菌株（如*Rhodotorula*或* Cryptococcus*属）。
- **代谢通路不明确**：iridoids的异构化（如DAA→ASPA）机制尚未阐明，需结合转录组学（RNA-seq）和代谢组学（MS）解析关键酶。
- **规模化挑战**：实验室级发酵（80 mL）与工业级（100 L）的代谢差异显著，需开展中试研究（Zhang et al., 2023）。

#### 7. 结论
本研究证实非酿酒酵母可通过代谢调控改善非伊果基产品的风味与功能性。其中，*P. kluyveri* Frootzen在增值率、酯类合成及异味降解方面表现最优，其发酵产物中异丁基乙酸和2-苯基乙醇酸酯浓度分别达291 μg/L和690 μg/L，显著高于其他组。同时，iridoids总量保持稳定（+3%），表明发酵工艺未破坏核心活性成分。建议将*P. kluyveri* Frootzen作为工业化发酵的首选菌株，并进一步优化工艺参数以平衡风味提升与营养保留。后续研究可结合感官组学（如电子鼻和味觉受体筛选）量化改进效果。