巨噬细胞整合素αV(ITGAV)在心肌梗死后修复与重塑中的非必需作用及其对纤连蛋白信号传导的无关性

《Communications Biology》：Macrophage ITGAV is dispensable for post-infarction remodeling in mice and does not mediate fibronectin responses

本研究针对巨噬细胞整合素αV(ITGAV)在心肌梗死修复中的作用这一未知领域，通过髓系细胞和巨噬细胞特异性ITGAV敲除小鼠模型结合体外实验，首次证实ITGAV虽在梗死巨噬细胞亚群中高表达，但对心脏功能恢复、炎症反应、纤维化和血管生成等关键修复过程均无显著影响。更重要的是，研究发现纤连蛋白(FN)对巨噬细胞转录组的深刻调控作用独立于ITGAV信号通路，这为理解心肌梗死后的修复机制提供了新视角，并对整合素靶向治疗策略的开发具有重要启示意义。

　　

当心脏的冠状动脉突然阻塞，导致心肌细胞因缺氧而大量死亡时，就会发生急性心肌梗死。成年哺乳动物的心脏几乎无法再生新的心肌细胞，因此梗死后的修复过程完全依赖于一系列精细调控的细胞反应，最终形成以胶原蛋白为主的瘢痕组织来替代坏死的心肌。在这个复杂的修复过程中，巨噬细胞作为核心效应细胞，发挥着至关重要的作用。它们不仅负责清除坏死的细胞碎片，还通过分泌各种细胞因子和生长因子，精密调控着炎症反应的启停、成纤维细胞的活化、新生血管的形成以及细胞外基质的重塑。

巨噬细胞能够感知其周围微环境的动态变化，这种感知能力部分通过细胞表面的整合素家族受体实现。整合素是由α和β亚基组成的异二聚体跨膜蛋白，能够识别细胞外基质中的特定成分，并将机械和化学信号传导至细胞内部，从而影响细胞的迁移、增殖和分化等行为。其中，整合素αV(ITGAV)在体外研究中被证实广泛表达于巨噬细胞，并被认为可能参与调控巨噬细胞的炎症激活、吞噬功能以及向修复性表型极化。例如，有研究提示ITGAV可能通过局部激活转化生长因子-β(TGF-β)来促进巨噬细胞的抗炎状态。然而，这些认识大多源于体外实验，ITGAV在活体动物体内，特别是在心肌梗死这种复杂的组织损伤和修复环境中，究竟扮演何种角色，至今仍不明确。解决这一问题对于深入理解心脏修复的细胞分子机制，以及评估将ITGAV作为治疗靶点的潜在价值都至关重要。

为此，由Ruoshui Li、Shuaibo Huang、Anis Hanna、Silvia C. Hernandez、Akihiko Kubota、Claudio Humeres、Izabela Tuleta和Nikolaos G. Frangogiannis组成的研究团队在《Communications Biology》上发表了他们的最新研究成果。为了回答巨噬细胞ITGAV是否调控心肌梗死后的修复过程，研究人员综合运用了多种技术方法。他们构建了髓系细胞特异性(LyzM-Cre)和巨噬细胞特异性诱导性(CX3CR1-CreER)的ITGAV基因敲除小鼠模型，并对其施加了永久性左前降支冠状动脉结扎手术以模拟心肌梗死。通过超声心动图系统评估了小鼠心脏的功能和结构重塑。组织学分析（包括免疫荧光染色和天狼星红染色）被用于量化梗死区巨噬细胞浸润、肌成纤维细胞积累、胶原沉积和血管密度。此外，研究人员还对公开的单细胞RNA测序数据进行了深入分析，以探究ITGAV及其伙伴β亚基在梗死心脏不同巨噬细胞亚群中的表达谱。在体外实验中，他们利用RNA测序技术全面分析了纤连蛋白刺激以及ITGAV中和抗体处理对小鼠骨髓来源巨噬细胞转录组的影响。

Expression of Itgav and its partner chains Itgb1 and Itgb5 in infarct macrophages.

通过对已发表的单细胞RNA测序数据的分析，研究人员发现Itgav基因在假手术组和心肌梗死组小鼠心脏的所有巨噬细胞亚群中均有表达，但并非均匀分布。在假手术心脏中，心脏组织驻留巨噬细胞亚群的Itgav表达水平相对较低。而在心肌梗死发生后第3天，具有促炎特征的M1样巨噬细胞中Itgav表达最高；到第7天，具有修复特征的M2样巨噬细胞则表现出最高的Itgav水平。在ITGAV的伴侣β链中，Itgb1和Itgb5在心脏巨噬细胞中广泛表达，而Itgb3、Itgb6和Itgb8的表达水平极低。这表明ITGAV可能与ITGB1或ITGB5形成异二聚体，在梗死区的巨噬细胞亚群中发挥作用。

Time course of ITGAV expression in infarct macrophages.

利用巨噬细胞报告小鼠(CSF1R-EGFP)进行免疫荧光染色，研究人员明确了ITGAV蛋白在梗死区巨噬细胞中的表达时程。结果显示，在心肌梗死后的炎症期（24小时至3天），大量巨噬细胞浸润梗死区，但其中仅有少部分表达ITGAV。到了增殖期（第7天），表达ITGAV的巨噬细胞数量显著增加，约占梗死区巨噬细胞总数的10-15%。在瘢痕成熟期（第28天），ITGAV阳性巨噬细胞的密度有所下降。这表明ITGAV主要在修复阶段的特定巨噬细胞亚群中表达。

Myeloid cell-specific loss of ITGAV does not affect mortality, dysfunction, and adverse remodeling after myocardial infarction.

为了在体内研究巨噬细胞ITGAV的功能，研究人员首先使用了LyzM-Cre工具小鼠构建髓系细胞特异性ITGAV敲除小鼠。Western blotting证实敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞中ITGAV蛋白水平显著降低。重要的是，心肌梗死后，与对照小鼠相比，敲除小鼠在死亡率、左心室射血分数下降程度、左心室舒张末期和收缩末期容积增大程度等关键指标上均无显著差异。这意味着髓系细胞（包括巨噬细胞和中性粒细胞）缺失ITGAV并未对心脏整体功能和不良重塑产生明显影响。

Myeloid cell-specific ITGAV loss does not affect scar remodeling following infarction

通过系统的形态计量学分析，研究人员进一步评估了瘢痕本身的变化。他们发现，无论是在心肌梗死后第7天（肉芽组织形成期）还是第28天（瘢痕成熟期），敲除小鼠与对照小鼠在梗死灶体积、存活心肌体积以及瘢痕占左心室总体积的百分比上均无统计学差异。这表明ITGAV的缺失不影响坏死组织的清除和胶原瘢痕的形成与收缩。

Myeloid cell-specific loss of ITGAV does not affect macrophage infiltration... myofibroblast infiltration... collagen deposition... angiogenesis.

随后，研究团队对修复过程中的关键细胞和分子事件进行了细致的量化分析。免疫荧光染色结果显示，ITGAV敲除并未显著改变梗死区巨噬细胞的浸润密度。虽然敲除小鼠在梗死后第7天显示出肌成纤维细胞密度降低约20%的趋势，但这一差异未达到统计学显著性，到第28天则与对照组无差异。同样，天狼星红染色评估的胶原含量以及CD31免疫组化标记的微血管密度在两组之间也无显著不同。这些数据表明，髓系细胞ITGAV信号通路在调控心肌梗死后炎症细胞招募、成纤维细胞活化、纤维化和血管生成等核心修复环节中并非必需。

Macrophage-specific ITGAV loss does not affect post-infarction remodeling.

考虑到LyzM-Cre也会靶向中性粒细胞，研究人员又使用了更具特异性的CX3CR1-CreER小鼠来诱导性敲除巨噬细胞中的ITGAV。无论采用梗死前单次他莫昔芬诱导方案，还是包含梗死前后两次给药的强化诱导方案，巨噬细胞特异性ITGAV敲除小鼠在心肌梗死后的死亡率、心脏功能指标（左心室射血分数、心室容积）以及心脏/体重比、肺/体重比等反映心脏负荷和肺充血的指标上，均与对照小鼠无异。组织学分析也再次证实，瘢痕大小、巨噬细胞和肌成纤维细胞密度未受显著影响。这进一步排除了中性粒细胞的潜在干扰，确证了巨噬细胞本身的ITGAV在心肌梗死修复中作用有限。

In vitro effects of ITGAV neutralization on the transcriptional profile of bone marrow macrophages(BMM)

最后，研究人员转向体外实验，旨在探究ITGAV调控巨噬细胞表型的潜在分子机制。他们重点关注了纤连蛋白，因为这种富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的基质蛋白是ITGAV的经典配体之一，并且在愈合中的心肌梗死区大量表达。RNA测序分析显示，纤连蛋白刺激能深刻重编程巨噬细胞的转录组，显著上调包括肿瘤坏死因子、C-C motif趋化因子配体2在内的促炎基因、细胞周期相关基因以及纤溶酶原激活物及其受体等细胞外基质降解相关基因的表达。然而，当使用中和抗体阻断ITGAV的功能后，纤连蛋白诱导的这些基因表达变化依然发生，且幅度相似。相反，单独阻断ITGAV对巨噬细胞转录组的影响非常有限，仅在未受纤连蛋白刺激的细胞中轻微上调了Fos等少数基因。这表明，纤连蛋白对巨噬细胞强大的激活效应主要是通过ITGAV非依赖性的信号通路实现的。

综上所述，这项研究通过严谨的体内外实验证据表明，尽管巨噬细胞表达ITGAV，但该整合素在心肌梗死后的心脏修复和重塑过程中并非关键调节因子。其功能缺失不会对心脏功能恢复、炎症消退、纤维化 scarring 或血管生成产生实质性影响。更重要的是，研究发现基质蛋白纤连蛋白对巨噬细胞炎症和修复相关基因表达的强烈诱导作用不依赖于ITGAV。这一发现挑战了此前基于体外研究形成的认知，即ITGAV是巨噬细胞感知基质微环境变化的核心受体。研究结果提示，在心肌梗死这类复杂组织修复场景中，可能存在其他整合素或受体分子补偿了ITGAV的功能，或者纤连蛋白通过其其他受体（如整合素α5β1）来发挥主导作用。该研究不仅深化了我们对心脏修复机制的理解，也对开发针对整合素的抗纤维化治疗策略具有重要的参考价值，提示此类药物的疗效可能主要通过作用于成纤维细胞或血管细胞而非巨噬细胞来实现。