基于血浆游离DNA全基因组甲基化图谱揭示年龄与性别相关表观遗传特征及其健康监测价值

《Communications Medicine》：Whole-genome profiling of age- and sex-associated DNA methylation signatures in human plasma cell-free DNA

本研究针对现有DNA甲基化研究多局限于芯片覆盖位点、难以全面揭示年龄与性别对全基因组甲基化影响的问题，通过对98名22-77岁健康成年人血浆游离DNA进行全基因组重亚硫酸盐测序，首次在全基因组层面系统绘制了年龄与性别相关的cfDNA甲基化图谱。研究发现3047个年龄相关CpG位点（对应1587个基因）和1053个性别相关CpG位点（对应324个基因），其中多数为新发现位点；构建的cfDNA表观遗传时钟（125个CpG位点）展示出较高年龄预测精度（r=0.91，MAE=3.74年）；组织溯源分析揭示单核/巨噬细胞、粒细胞和肝细胞来源cfDNA与年龄、性别存在显著关联，并在个体健康异常者中发现特定细胞类型cfDNA比例异常。该研究为年龄相关和性别偏倚疾病机制提供新见解，证实cfDNA甲基化特征作为健康监测生物标志物的巨大潜力。

　　

随着人口老龄化进程加速，深入理解衰老的生物学机制已成为生命科学领域的焦点课题。DNA甲基化作为重要的表观遗传修饰，在基因表达调控和衰老进程中扮演关键角色。然而，现有研究多采用Illumina 450K/850K甲基化芯片，仅覆盖人类基因组约3%的CpG位点，这严重限制了我们对全基因组范围内年龄和性别相关甲基化模式的认识。与此同时，血浆细胞游离DNA(cfDNA)因其无创、实时反映机体生理病理状态的独特优势，已成为液体活检的重要工具，但其在健康人群年龄与性别差异方面的系统研究仍较为缺乏。

在这项发表于《Communications Medicine》的研究中，研究人员通过高深度的全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术，对98名22-77岁健康成年人的血浆cfDNA甲基化谱进行了全面分析，揭示了年龄和性别对cfDNA甲基化的深刻影响，并探索了其作为健康监测生物标志物的潜力。

研究采用了多项关键技术方法：从98名健康成年人（52名女性、46名男性）采集外周血样本，通过两步离心法分离血浆并提取cfDNA；使用SPLAT单链文库构建技术进行WGBS文库制备，在DNBSEQ平台进行100-bp双端测序，平均测序深度>30×；使用BitMapperBS进行序列比对，MethylDackel计算甲基化水平；通过线性回归模型识别年龄和性别相关CpG位点；采用弹性网络回归构建表观遗传时钟；利用已发表的甲基化图谱进行组织溯源分析。

年龄相关DNA甲基化模式

研究人员共鉴定出3047个与年龄显著相关的自体CpG位点，其中2854个位点（94%）呈现随年龄增长甲基化水平下降的负相关关系，193个位点（6%）呈现正相关。这些位点显著富集于启动子、5'UTR、增强子、CpG岛和CpG岸等基因调控区域。与现有数据库对比发现，大多数年龄相关CpG位点为首次报道，仅71个和208个位点分别被450K和850K芯片覆盖。这些位点对应1587个基因，其中FIGN基因包含最多年龄相关CpG位点（58个）。功能富集分析显示这些基因显著富集于cAMP信号通路、TNF信号通路、TRP通道调控、癌症、GnRH分泌和神经退行性病变等与衰老密切相关的通路。

基于cfDNA的甲基化表观遗传时钟

基于3047个年龄相关CpG位点，研究团队构建了一个包含125个CpG位点的cfDNA甲基化时钟模型。该模型在留一法交叉验证中表现出较高预测精度，实际年龄与表观遗传年龄的Pearson相关系数达0.91，中位绝对误差为3.74年。外部验证数据集（23名健康个体）也证实了模型的可靠性（r=0.94，MAE=9.44年）。与现有表观遗传时钟相比，本研究中的大多数CpG位点为新发现位点，仅少数与Hannum时钟（2个）和Horvath皮肤与血液时钟（3个）重叠。

性别相关DNA甲基化模式

在自体染色体上，研究鉴定出1053个与性别显著相关的CpG位点，包括727个女性高甲基化位点和326个男性高甲基化位点。这些位点对应324个基因，其中LINC01597基因包含最多女性高甲基化位点（33个），PTPRN2/LOC105375614基因包含最多男性高甲基化位点（16个）。功能分析显示这些基因显著富集于MAPK信号通路、钙信号通路、唾液分泌、吗啡成瘾等通路，以及多种与神经功能相关的GO条目，与已知的性别偏倚疾病机制相吻合。

X染色体性别特异性甲基化

在X染色体上，研究人员发现638，599个CpG位点（64%）显示性别差异，其中29，446个位点达到更严格显著性阈值。通过分析女性与男性甲基化水平的相关性，识别出五种甲基化模式：模式A（28，464个位点）在女性中甲基化水平显著更高，可能反映X染色体失活（XCI）；模式B（13，018个位点）在两性中均低甲基化（<0.25），可能逃避XCI；模式C（561，972个位点）在两性中均高甲基化（>0.75）；模式D（265，880个位点）在男性中甲基化水平更高；其余为模式其他（121，573个位点）。功能分析显示模式A和B的基因显著富集于NF-κB通路、原发性免疫缺陷、Polycomb抑制复合体等与XCI状态相关的通路。

健康个体中cfDNA组织来源特征

组织溯源分析显示，粒细胞、红细胞前体细胞、单核细胞/巨噬细胞和NK细胞等血细胞是cfDNA的主要来源。研究发现粒细胞来源cfDNA比例随年龄增长仅在女性中显著增加，单核/巨噬细胞来源cfDNA比例在年轻女性中高于男性，且随年龄增长仅在女性中显著下降。肝细胞来源cfDNA在器官中占比最高，且在老年男性中显著高于年轻男性和女性群体，与ALT、AST、GGT等肝功能指标呈正相关，与高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）呈负相关。

研究还发现了几例组织溯源结果异常的个体：EB069（痛风病史）单核/巨噬细胞来源cfDNA比例异常高；EB080（高血压）粒细胞来源cfDNA比例异常高；EB005（血小板增多症）红细胞前体和巨核细胞来源cfDNA比例异常高；EB071（肝酶升高）肝细胞来源cfDNA比例最高。这些发现表明cfDNA组织溯源可能反映个体潜在健康问题。

研究结论与意义

该研究通过全基因组cfDNA甲基化分析，首次在全基因组层面系统揭示了健康人群中年龄和性别对甲基化模式的深刻影响。发现的年龄和性别相关CpG位点及基因为理解精神疾病、糖尿病、自身免疫疾病等年龄相关和性别偏倚疾病提供了新视角。构建的cfDNA表观遗传时钟展示了基于液体活检进行生物学年龄评估的可行性。组织溯源分析结果不仅揭示了年龄和性别对cfDNA细胞来源的影响，还通过异常个体案例证明了cfDNA甲基化特征在健康监测中的应用潜力。尽管存在样本量有限、人群特异性等局限性，该研究为未来cfDNA甲基化研究和液体活检应用奠定了重要基础，推动了表观遗传学在精准健康领域的应用发展。